14.1.5. Імунофлюоресцентні методи

Реакція імунофлюоресценції (РІФ) для визначення антигенів була запропонована у 1950 р. А. Кунсом. Даний метод базується на тому, що імуноглобуліни здатні необоротно зв’язуватись з флюоресцентними барвниками (флюорохромами) без втрати антитільної активності і здібності зв’язувати антигени. Імунні комплекси, що утворилися при зв’язуванні антигенів міченими антитілами виявляють за допомогою люмінісцентного мікроскопа. При опроміненні коротковолновим світлом (ультрафіолетовим, фіолетовим, синім) виявляється специфічне люмінісцентне світіння, наприклад, ізотіоционат флюоресцеїна дає зелено-жовте забарвлення, інші флюорохроми – інші люмінісцентні кольори. Хоча методи імунофлюоресценції більш складні, ніж описані вище, вони мають значні переваги, а саме: дозволяють швидко визначати різноманітні антигени (вірусні, бактеріальні, тканинні, внутрішньоклітинні) у дуже малій кількості; на одному предметному склі можна виявити антитіла до декількох різних антигенів; при виявленні тканинних і внутришньоклітинних антигенів можна встановити їх локалізацію. Методи флюоресценції застосовуютьсятакож для виявлення антигенів на поверхні живих клітин (див. Методи вивчення клітинного імунітету). Існує декілька варіантів РІФ: метод прямої флюоресценції, метод непрямої флюоресценції, непрямий флюоресцентний метод зі зв’язуванням комплемента.

Метод прямої флюоресценції використовують при наявності мічених флюорохромом антитіл до певного антигена. Розчин мічених Igнаносять на препарат, що містить антигени (зрізи тканин, препарати бактерій або фіксованих вірусів). Проводять інкубацію, після чого відмивають препарат від надлишка антитіл, а далі виявляють зв’язані антигеном антитіла за допомогою люмінісцентного мікроскопа.

Метод непрямої флюоресценції передбачає наявність мічених флюорохромом антиімуноглобулінових антитіл, які можуть приєднуватись до Fc-фрагментів антитіл діагностичної сироватки, що вже специфічно зв’язалися з антигенами. Антиімуноглобулінові антитіла отримують шляхом імунізації кіз або баранів кролячими діагностичними сироватками. Спочатку препарати антигенів обробляють розчинами різних діагностичних сироваток (немічені антитіла), а після інкубації і відмивки надлишкової кількості антитіл препарати заливають розчином антиімуноглобулінових антитіл мічених флюорохромом. Світіння виявляють тільки в тому препараті, де відбулося специфічне зв’язування антигена з антитілами діагностичної сироватки. Непряма імунофлюоесценція у порівнянні з прямим методом має перевагу в тому, що не потребує наявності багатої кількості мічених антитіл до різних антигенів. За допомогою непрямої імунофлюоресценції можна проводити серологічну діагностику інфекційних захворювань, виявляючи антигени мікроорганізмів (наприклад мікоплазм) або антитіла у сироватці хворих.

Непрямий флюоресцентний метод зі зв’язуванням комплемента застосовується для визначення комплемент-зв’язуючих антитіл. На препарат, що містить антигени, спочатку наносять розчин антитіл, а потім свіжу сироватку, як джерело комплемента. Комплемент активується за класичним шляхом, причому одна молекула антитіла, зв’язаного з антигеном, може приєднувати багато молекул С3b. Останні виявляються завдяки додатковій обробці препарата антитілами проти С3b, міченими флюорохромом.

14.1.6. Імуносорбентний аналіз

Імуносорбентний аналіз включає методи, основані (як і імунофлюоресценція) на здатності антитіл сорбувати різні хімічні речовини – ліганди. Найбільш розповсюджені із цієї групи методів ІФА (імунофермнтний аналіз) та РІМ (радіоімунний метод). При ІФА використовують антитіла мічені ферментом, при постановці РІМ – антитіла мічені радіоізотопами. В англомовній літературі метод імуноферментного аналізу отримав назвуELISA(Enzyme-LinkedImunosorbentAssay). Імуносорбентні методи відрізняються від традиційних серологічних реакцій високою чутливістю, економічністю, дозволяють досліджувати велику кількість зразків за короткий час. За допомогою ІФА і РІМ можна визначити антигени будь-якого збудника і антитіла до них у крові хворих. Цю групу методів називають ще твердофазним аналізом, оскільки антигени або антитіла сорбують на твердій фазі – у лунках пластмасових мікропанелей (планшеток), на кульках, ковпачках, полосках (стрипах) тощо.

Виявлення антигенів за допомогою ІФА і РІМ проводять у три етапи:

І етап – адсорбція специфічних антитіл на поверхні лунок полістиролових або полівінілхлоридних мікропанелей, тобто на поверхні твердої фази. Адсорбція відбувається за рахунок Fc-фрагментів антитіл, а їх активні центри залишаються вільними і здатні зв’язувати антигени.

ІІ етап – додавання антигена – суспензії клінічного матерала. Антигени зв’язуються з фіксованими на поверхні твердої фази антитілами. Комплекси “антиген-антитіло” утворюються на межі тверда фаза - рідина. Далі луночки промивають слабким неіонним детергентом для позбавлення від неспецифічно зв’язаних з антитілами компонентів.

ІІІ етап – додаткова обробка міченими (ферментом або радіоізотопом) антитілами специфічними до антигена. Якщо існує специфічна відповідність адсорбованих на твердій фазі антитіл і антигена, в результаті додавання мічених антитіл утворюються комплекси “антитіло + антиген + мічене антитіло”, які виявляють залежно від мітки. При ІФА до утвореного комплекса додають розчин речовини, що є субстратом фермента, яким помічені антитіла. Так, при використанні у якості ліганда пероксидази у лунки планшеток додають ортофенилендіамін у фосфатно-цитратному буфері з рН 5,0. Під впливом пероксидази субстрат модифікується з утворенням продуктів з жовтим забарвленням, інтенсивність якого вимірюють фотометричним методом. Результат РІМ визичають за рівнем радіоактивності досліджуваних зразків, у дослідних пробах вона більш, ніж у 2 рази перевищує контрольні зразки. Слід відмітити, що у зв’язку з певною небезпекою при роботі з радоізотопами, РІМ в останні роки все частіше замінюють на РІФ (реакція імунофлюоресценції).

За допомогою ІФА та РІМ можна виявляти не тільки антигени, а й антитіла. Для цього у сенсибілізовані лунки планшетки вносять антигени, або використовують комерційні тест-системи з адсорбованими у лунках антигенами. В планшетки з антигеном додають досліджувану сироватку, проводять інкубацію. Після відмивання антитіл, що не зв’язалися з антигеном, в систему антиген-антитіло додають мічені ферментом або радіоізотопом антиглобулінові антитіла. Як контрольні аналізують позитивні та негативні зразки. Результати реакції оцінюють так само, як вже було описано вище.

Окрім широкорозповсюджених методів, представлених у даному розділі, раніше (у розділі 4 “Антитіла”) вже були розглянуті методи виділення і очищення імуноглобулінів, отримання моноклональних антитіл.