14.3. Методи вивчення функціональної активності клітин

Ця група включає різноманітні методи, що застосовуються для оцінки фізіологічного стану клітин імунної системи під впливом різних речовин або чужорідних клітин.

14.3.1.Реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ)

РБТЛ дозволяє оцінити готовність лімфоцитів “відповідати” на антиген. Відповідь на антиген моделюють за рахунок додавання різних стимуляторів (мітогенів, антигенів), в результаті чого малі лімфоцити перетворюються у бласты – великі клітини, що активно діляться і диференціюються. В процесі бласттрансформації відбуваються морфологічні та фізіологічні зміни лімфоцитів – збільшення ядра, підвищення кількості мітохондрій, лізосом та рибосом, активація біосинтетичних процесів.

В якості стимуліторів бласттрансформації лімфоцитів звичайно застосовують мітогени – речовини, які підвищують інтенсивність мітозів. На практиці як стимулятори бласттрансформації найбільш часто використовують:

• рослинні мітогени: фітогемагглютінін (ФГА), конканавалін А (Кон А), митоген лаконоса (МЛ);

• мікробні мітогени: бактеріальні ліпополісахаріди (ЛПС), ферменти, екстракти з клітин стафілокока та стрептокока, білок А стафілокока, туберкулін мікобактерій, компоненти капсул, джгутиків, клітинних стінок тощо;

• мітогени тваринного походження: чужорідні Ig та ін.

Перелічені мітогени розрізняються інтенсивністю дії у відношенні різних популяцій лімфоцитів. Так, ФГА і Кон А стимулюють Т-лімфоцити, ЛПС бактерій (Е. coli, сальмонел та ін.), туберкулін, декстрани, імуноглобуліни стимулюють бласттрансформацію переважно В-клітин. Митоген лаконоса стимулює клітини обох типів. Таким чином, підбираючи мітогени, можна вивчати функціональну активність окремих субпопуляцій лімфоцитів.

При постанові реакції до суспензії лімфоцитів додають розчин мітогена у нетоксичній для клітин концентрації. Після інкубації (при 37°С) проводять лізис еритроцитів (якщо використовується цільна кров) і підраховують кількість клітин, що трансформувалися у бласти. Аналіз результатів проводять візуально у пофарбованих мазках, або по зміні радіоактивності лімфоцитів, що входять у мітотический цикл (при попередньому введенні радіоактивного 3Н-тімідина у клітини). Для підрахунку “радіоактивних” клітин використовують автоматичний сцинтіляційний лічильник. Для оптимального протікання РБТЛ необхідна присутність макрофагів, тому високоочищені лімфоцити звичайно не використовуються. Постановка реакції і культивування повинні здійснюватися в стерильних умовах. Тому використання РБТЛ у клініці для кількісної оцінки субпопуляцій лімфоцитів у даний час у значній мірі утратило своє значення в зв'язку з появою більш простих методів (розеткоутворення, мембранної иммунофлуоресценції з міченими моноклональними антитілами, стрептавідін-біотинового методу й ін.). Однак досить великим залишається значення бласттрансформації для визначення фізіологічної активності (проліферативного потенціалу) клітин як на неспецифічні активатори (мітогени), так і на специфічні (антигени найпростіших, грибів, бактерій, вірусів, тканин організму).