Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Биохимия в животноводстве. Учебное пособие

.pdf
Скачиваний:
0
Добавлен:
07.09.2026
Размер:
2 Мб
Скачать
чеством инфекционных центров (бляшек, негативных колоний), приходящихся на молекулу или единицу массы нуклеиновой ки­слоты вируса. Процесс, в результате которого экзогенная ДНК проникает в реципиентную клетку и вызывает наследственные ее изменения, называют трансформацией. Трансформацию могут осуществлять как молекулы ДНК, реплицирующиеся в клетках внехромосомно (плазмиды), так и молекулы ДНК, интегрирую­щиеся в геном клетки (плазмиды, линейные фрагменты ДНК). Данную генетическую (биохимическую) трансформацию необхо­димо отличать от онкогенной трансформации клеток животных. Генетически трансформированные клетки принято называть трансформантами. Эффективность трансформации обычно вы­ражают количеством клонов (колоний, образованных при деле­нии индивидуальной клетки) трансформантов, приходящихся на молекулу или единицу массы донорной ДНК.
Физиологическое состояние клетки, в котором она способна включать нативную нуклеиновую кислоту из окружающей среды, называется компетентностью. Однако многие бактерии, а также дрожжи и культивируемые клетки животных такой физиологиче­ской активностью не обладают. Поэтому восприимчивость к эк­зогенной ДНК у них индуцируют различными способами.
После встройки в выбранный вектор фрагментов экзогенной ДНК смесь молекул ДНК вводят в компетентные клетки.
При трансформации клеток чаще всего используются век­торные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибио­тикам и антиметаболитам. Поэтому на среде с определенным ан­тибиотиком или антиметаболитом будут расти только клетки трансформантов. Особенно хорошо данная система селекции от­работана для бактериальных клеток, так как получены векторные плазмиды, детерминирующие устойчивость трансформирован­ных клеток сразу с несколькими различными антибиотиками. Ес­ли векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибио­тикам и при встройке в нее экзогенного фрагмента ДНК наруша­ется одна из генетических детерминант устойчивости к антибио­тикам, то клоны клеток, содержащих такие гибридные ДНК, лег­ко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор, на соответствующих средах с каждым антибиотиком в отдельно­сти. Например, если векторная плазмида детерминирует устойчи-
21
вость одновременно к тетрациклину и ампициллину и при встройке чужеродного фрагмента в нее нарушается ген устойчи­вости к ампициллину, то гибридная плазмида будет сообщать клетке-хозяину уже другой фенотип, т. е. устойчивость к тетра­циклину и чувствительности к ампициллину. Поэтому после та­кой встройки фрагментов ДНК в данный вектор плазмиды вводят в клетки, и клетки высевают на чашки с агаризованной питатель­ной средой, в которую добавлен тетрациклин. При этом вырас­тают колонии клеток, содержащих как исходную векторную плазмиду, так и гибридные плазмиды.
Большой интерес для генетической инженерии представляет достижение правильной экспрессии клонированной генетической информации в реципиентных клетках. Такую экспрессию легко выявить в том случае, когда клонируемый ген при правильной транскрипции и трансляции в клетке обеспечивает функциональ- ную комплементацию мутаций в геноме этой клетки. В этом слу­чае нужный гибрид может быть выявлен простым отбором трансформированных клонов на селективной среде.
Для поиска требуемых клонов гибридов можно использо­вать метод радиоиммуноанализа белков.
B основу метода положено то, что молекулы иммуноглобу­линов (антител) способны достаточно просто связываться с поли­стиролом или поливинилом. Кроме того, предполагается, что ис­следуемый антиген может связывать по крайне мере две молеку­лы антител.
Как видим, существует комплекс методов, позволяющий осуществлять эффективный целенаправленный отбор необходи­мых гибридных клонов.
1.3.5. Генная инженерия в животноводстве
Генетическая инженерия открыла небывалые ранее возмож­ности по созданию принципиально новых микробиологических продуцентов биологически активных веществ.
Так с помощью методов генной инженерии синтезирован ген, кодирующий лимфотоксин – белок, убивающий опухолевые клетки. Промышленное производство интерферона и иммуногло­булина, обладающих противовирусным действием, стало воз­можным благодаря успехам генной инженерии.
22
В бактерию кишечной палочки была внесена молекула ДНК, кодирующая белок вируса ящура – болезни, поражающей круп­ный рогатый скот и приносящий огромные убытки животново­дам. Сегменты ДНК, введенные в бактерию, стали продуцировать белок вируса ящура, который используют для иммунизации жи­вотных.
Возможность встраивания участка ДНК млекопитающих в ДНК бактерий кишечной палочки была использована для про­мышленного синтеза гормона поджелудочной железы инсулина, гормона гипофиза соматотропина.
В настоящее время еще сохраняется большая потребность в безопасных вакцинах, используемых в ветеринарии.
Путем микробиологического синтеза, основанного на выве­дении и использовании специальных штаммов микроорганизмов, продуцирующих ту или иную аминокислоту, получают в про­мышленности кормовой белок, незаменимые аминокислоты – ли­зин, триптофан, метионин, треонин. Ведутся поиски микробило­гического синтеза других незаменимых аминокислот.
Однако достижения генной инженерии надо использовать разумно, не нарушая экологического равновесия в природе.
Произвольное изменение генетического материала способно нарушить взаимоотношение всех видов живых организмов и мо­жет стать катастрофой для человечества.
1.3.5.1. Генетически модифицированные продукты питания
Генетически модифицированные (трансгенные) продукты питания представляют особый интерес. Сообщения о генетически модифицированных растениях и полученных из них продуктах питания появились в начале 90-х гг. В настоящее время генетиче­скому изменению подвергается важнейшее растительное сырье, а без использования растительного сырья получают лишь очень немногие продукты.
Успехи в области генной инженерии позволяют получать новые сорта растений (причем в течение всего 2-3 лет) с задан­ными свойствами. За счет встраивания генов, выделенных из од­них организмов и несущих определенную генетическую инфор­мацию (например, устойчивость к заморозкам, гербицидам, бо-
23
лезням и паразитам, высокая урожайность, неполегаемость и др.) в ДНК других, были получены растения, которые называют трансгенными, т. е. с перемещенными генами.
В США в настоящее время насчитывается более 150 наиме­нований генетически измененных продуктов, а площади в разных странах, на которых произрастают трансгенные растения, состав­ляют по разным оценкам от 10 до 25 млн га. Трансгенные расте­ния выращивают в США, Канаде, Японии, Китае, Бразилии, Ар­гентине и многих других странах. Европейские государства за­нимают в этом отношении более жесткую позицию. По прогно­зам мировой рынок трансгенных культур достигнет приблизи­тельно 8 млрд долларов США к 2005 г. и 25 млрд долларов США к 2010 г.
В настоящее время среди промышленно выращиваемых трансгенных растений доля устойчивых к гербицидам составляет 71%, устойчивых к вредителям – 22%, устойчивых одновременно и к гербицидам, и к вредителям – 7%, устойчивых к вирусным, бактериальным и грибным болезням – менее 1%.
К трансгенным продуктам можно отнести генетически из­мененную сою, устойчивую к гербицидам. Как известно, соя ис­пользуется для приготовления 30 000 пищевых продуктов: супов, детского питания, картофельных чипсов, маргарина, салатных соусов, рыбных консервов и др. Кроме сои, наибольшее распро­странение получили трансгенные помидоры, кукуруза, рис, кар­тофель, клубника, а также генетически модифицированные дрожжи и ферментные препараты, полученные из трансгенных микроорганизмов.
Известны ферментные препараты, полученные из генетиче­ски модифицированных микроорганизмов. Основными фермент­ными препаратами, полученными методами генной инженерии, являются: α-амилаза из В. stearothermophilus, экстрессированная в В. subtilis; α-амилаза В. megaterium, экстрессированная в В. subtilis; химозин А, полученный из штамма Е. coli К- 1 2, содер­жащего ген телячьего прохимозина А. Кроме того, при производ­стве глюкозного сиропа из кукурузного крахмала применяются ферменты из генетически измененных бактерий. В Германии по­лучены трансгенные пектиназы, используемые при производстве соков и вин. Генная инженерия находит применение и в живот-
24
новодстве, влияя на рост и продуктивность сельскохозяйствен­ных животных.
Возможны различные подходы к оценке генетически изме­ненного сырья и готовых пищевых продуктов из него. Это можно проиллюстрировать на примере трансгенной сои и продуктов ее переработки (рис. 9).
Рис. 9. Возможные продукты переработки трансгенной сои
Из трансгенного сырья (х) при технологической переработке (в зависимости от способа) можно получить продукты как содер­жащие (х), так и не содержащие (о) генетически измененные компоненты. Например, из сои получают масло, которое может быть трансгенным (х) или нет (о). Соответственно продукты при изготовлении которых используется соевое масло, будут транс­генными (х) или обычными (о).
Безопасность генетически модифицированных продуктов питания остается все еще под вопросом. Хотя нет конкретных примеров серьезной экологической опасности трансгенных рас­тений в природной среде, на сегодняшний день нет и не может быть однозначного ответа на вопрос о возможной опасности от­даленных последствий таких продуктов, поскольку их потенци­альная опасность не подвергается сомнению.
Очевидно одно – трансгенная продукция должна проходить тщательную многофакторную проверку на безопасность и иметь специальную маркировку. Однако и в этом пока больше вопро­сов, чем ответов.
Все большее число стран старается регламентировать про­дажу «новых» пищевых продуктов. Так, в законе, принятом Ев­ропарламентом, на упаковках нерафинированного масла и поп-
25
корна из генетически измененной кукурузы должна быть соот­ветствующая маркировка, а на упаковке с крахмалом или полу­ченным из него глюкозным сиропом подобная маркировка не требуется. Маркировка не требуется на упаковке с рафинирован­ным маслом или приготовленном на его основе майонезе. Полу­ченный из генетически измененного яблока мусс или яблочный сок должны нести соответствующую маркировку, а яблочный ук­сус – нет. Не фиксируется факт использования генетически изме­ненного сырья при изготовлении лецитина и получении с его по­мощью шоколада и крема. Должны иметь соответствующую мар­кировку соевый шрот, белок, полученный из него, и готовые су­пы с данным белком. Корма для животных, полученные из шрота генетически измененной сои, не маркируются.
В странах Евросоюза в настоящее время барьер перед гене­тически измененной пищей сломан, однако, к потребителю до­пускается пища, в которой обнаруживаются только следы гене­тических изменений (рис. 10).
Рис. 10. Потенциальные риски применения трансгенных культур
В России с 1 июля 1999 г. вступило в силу постановление Министерства здравоохранения РФ «О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из гене­тически модифицированных источников». Согласно этому доку-
26
менту гигиеническая экспертиза пищевых продуктов и продо­вольственного сырья, а также компонентов (фрагментов) для их производства, полученных из генетически модифицированных источников, должна включать определение вносимой последова­тельности генов, маркерных генов антибиотиков, промотеров, стабильности генетически модифицированных организмов на протяжении нескольких поколений, а также санитарно-химичес­кие показатели качества и безопасности, результаты токсиколо­гических исследований на лабораторных животных, оценку ал­лергенных свойств продукта, возможных мутагенных, канцеро­генных и тератогенных эффектов. Кроме этого, обязательна тех­нологическая оценка пищевой продукции, полученной из генети­чески модифицированного сырья органолептических свойств и физико-химических параметров.
Успехи и возможности генной инженерии далеко не одно­значно воспринимаются человеческим сообществом, причем приоритеты неприятия время от времени изменяются. Вначале общественное мнение было встревожено генетической модифи­кацией кишечной палочки Е. соli. Предполагалось, что эти гене­тические трансформанты выйдут из-под контроля и станут при­чиной многих страшных заболеваний. К началу 90-х гг. XX в., когда оказалось, что эти страхи безосновательны, внимание пере­ключилось на трансгенные растения. К этому времени большие успехи в получении трансгенных сои, картофеля, кукурузы и других сельскохозяйственных культур были достигнуты в США. Преимущества устойчивых к сорнякам, насекомым и другим ус­ловиям окружающей среды растений были очевидны, однако по­требление генно-инженерных растительных продуктов в США и особенно в странах Западной Европы было ограничено из-за бо­язни отдаленных последствий воздействия генетически изменен­ных продуктов питания. То же самое касается трансгенных жи­вотных с повышенным содержанием гормона роста – соматотро­пина. Можно полагать, что в основном эти опасения безоснова­тельны, хотя бурно развивающиеся генно-инженерные исследо­вания должны находиться под контролем сообщества ученых, общественности и правительственных организаций.
27
2. НАУКА О ФЕРМЕНТАХПРАКТИКЕ
Практическое использование достижений энзимологии можно найти во всех областях деятельности человека, где речь идет о живых существах. Это и медицина, и животноводство, и растениеводство, и промышленная микробиология, и многие ви­ды пищевой промышленности.
2.1. Ферменты в лечебной практике
В лечебной практике можно выделить три главных направ­ления, где учению о ферментах принадлежит ведущая роль:
1) изучение болезней, причина которых лежит в недоста-
точности ферментов;
2) использование определения активности ферментов в био­логических жидкостях и тканях организма для диагностики раз­личных заболеваний;
3) применение ферментных препаратов в качестве лекарст­венных средств.
Генетически обусловленные нарушения химической
структуры ферментов – причина болезней
Мы видим, какой сложный и высокосовершенный меха­низм передачи наследственной информации и биосинтеза бел­ка существует в клетке. Время от времени в длинных цепях ДНК, где записана вся информация о синтезе белков, вдруг по­являются случайные замены: вместо одного нуклеотида стано­вится другой, или выпадает вовсе. Такие изменения называют­ся мутациями. Они возникают при физическом воздействии, радиоактивном облучении, под действием мутагенов. Может так случиться, что замена одного единственного нуклеотида в структурном гене приведет к тому, что в кодируемом этим ге­ном белке вместо одной аминокислоты появится другая, ко­ренным образом меняющая качество белка, в частности, ли­шающая его ферментативных свойств. Может быть и так, что нарушение нуклеотидной последовательности в определенном месте ДНК вообще лишит клетку способности синтезировать тот или иной фермент.
28
Нередки случаи, когда отсутствие или недостаточная актив­ность того или иного фермента вызывает болезненные явления, но не угрожает жизни.
Например, при недостатке в кишечнике фермента бета­галактозидазы, расщепляющего лактозу, наблюдается расстрой­ство пищеварения. Дело в том, что молочный сахар – лактоза – это дисахарид, состоящий из глюкозы и галактозы. Дисахариды в кишечнике не всасываются, они должны быть предварительно разложены на составные части. Отсутствие бета-галактозидазы делает невозможным такое разложение лактозы и тем самым препятствует ее усвоению.
Гораздо более тяжелым заболеванием, нередко приводя­щим к гибели новорожденных, является непереносимость про­стых углеводов – моносахаридов (галактозы и фруктозы). Здесь речь идет уже не о нарушении всасывания (в кровь из кишечника они всасываются легко), а о невозможности их нормального обмена в клетках из-за отсутствия необходимых ферментов. Непереносимость галактозы и непереносимость фруктозы – это разные заболевания и в основе их лежит дефи­цит разных ферментов, но в обоих случаях накапливаются фосфорилированные продукты – галактозо-1-фосфат и фрукто­зо-1-фосфат, избыточные концентрации которых ведут к глу­бокому нарушению обмена веществ.
Знание природы этих заболеваний дает в руки специалистов простое средство их лечения. Достаточно исключить из рациона субстраты отсутствующих ферментов, в приведенных примерах – галактозу и фруктозу, как наступает быстрое и практически пол­ное выздоровление.
Примерно у одного ребенка, из каждых 15 – 20 тысяч рож­дающихся на нашей планете, наблюдается слабоумие, известное под названием фенилпировиноградной олигофрении. Выясни­лось, что причина его – недостаток фермента фенилаланингид­роксилазы, катализирующей превращение аминокислоты фени­лаланина в тирозин:
29
ОН
СН2
СНNH2
COOH
Фенилаланин
Фенилаланин­гидроксилаза
СН2
СНNH2
COOH
Тирозин
Тирозин, отличающийся от фенилаланина лишь наличием
гидроксильной группы (ОН) в кольце, может вступать в самые различные реакции обмена веществ, тогда как возможности фе­нилаланина весьма ограничены. Если он не переходит в тирозин, то из него получаются вещества, близкие по строению к фенил­пировиноградной кислоте. Вещества эти оказывают губительное действие на развитие мозга и, если не принять необходимых мер, то они влекут за собой развитие умственной отсталости – слабо­умие:
Удалось разработать простой способ выявления этого де-
СООН – С = О СН2
Фенилпировиноградная кислота
фекта, основанный на том, что продукты обмена фенилаланина выделяются с мочой и могут быть обнаружены по появлению си­не-зеленой окраски в присутствии специального реактива. Мно­гие болезни крови имеют своей причиной наследственный недос­таток тех или иных ферментов. К таким болезням относятся не­которые формы малокровия, нарушения свертывания крови, со­провождающиеся опасной для жизни кровоточивостью, и др.
30