Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биохимия в животноводстве. Учебное пособие
.pdf
чеством инфекционных центров (бляшек, негативных колоний),
приходящихся на молекулу или единицу массы нуклеиновой кислоты вируса. Процесс, в результате которого экзогенная ДНК
проникает в реципиентную клетку и вызывает наследственные ее
изменения, называют трансформацией. Трансформацию могут
осуществлять как молекулы ДНК, реплицирующиеся в клетках
внехромосомно (плазмиды), так и молекулы ДНК, интегрирующиеся в геном клетки (плазмиды, линейные фрагменты ДНК).
Данную генетическую (биохимическую) трансформацию необходимо отличать от онкогенной трансформации клеток животных.
Генетически трансформированные клетки принято называть
трансформантами. Эффективность трансформации обычно выражают количеством клонов (колоний, образованных при делении индивидуальной клетки) трансформантов, приходящихся на
молекулу или единицу массы донорной ДНК.
Физиологическое состояние клетки, в котором она способна
включать нативную нуклеиновую кислоту из окружающей среды,
называется компетентностью. Однако многие бактерии, а также
дрожжи и культивируемые клетки животных такой физиологической активностью не обладают. Поэтому восприимчивость к экзогенной ДНК у них индуцируют различными способами.
После встройки в выбранный вектор фрагментов экзогенной
ДНК смесь молекул ДНК вводят в компетентные клетки.
При трансформации клеток чаще всего используются векторные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Поэтому на среде с определенным антибиотиком или антиметаболитом будут расти только клетки
трансформантов. Особенно хорошо данная система селекции отработана для бактериальных клеток, так как получены векторные
плазмиды, детерминирующие устойчивость трансформированных клеток сразу с несколькими различными антибиотиками. Если векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибиотикам и при встройке в нее экзогенного фрагмента ДНК нарушается одна из генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, то клоны клеток, содержащих такие гибридные ДНК, легко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор,
на соответствующих средах с каждым антибиотиком в отдельности. Например, если векторная плазмида детерминирует устойчи-
21

вость одновременно к тетрациклину и ампициллину и при
встройке чужеродного фрагмента в нее нарушается ген устойчивости к ампициллину, то гибридная плазмида будет сообщать
клетке-хозяину уже другой фенотип, т. е. устойчивость к тетрациклину и чувствительности к ампициллину. Поэтому после такой встройки фрагментов ДНК в данный вектор плазмиды вводят
в клетки, и клетки высевают на чашки с агаризованной питательной средой, в которую добавлен тетрациклин. При этом вырастают колонии клеток, содержащих как исходную векторную
плазмиду, так и гибридные плазмиды.
Большой интерес для генетической инженерии представляет
достижение правильной экспрессии клонированной генетической
информации в реципиентных клетках. Такую экспрессию легко
выявить в том случае, когда клонируемый ген при правильной
транскрипции и трансляции в клетке обеспечивает функциональ-
ную комплементацию мутаций в геноме этой клетки. В этом случае нужный гибрид может быть выявлен простым отбором
трансформированных клонов на селективной среде.
Для поиска требуемых клонов гибридов можно использовать метод радиоиммуноанализа белков.
B основу метода положено то, что молекулы иммуноглобулинов (антител) способны достаточно просто связываться с полистиролом или поливинилом. Кроме того, предполагается, что исследуемый антиген может связывать по крайне мере две молекулы антител.
Как видим, существует комплекс методов, позволяющий
осуществлять эффективный целенаправленный отбор необходимых гибридных клонов.
1.3.5. Генная инженерия в животноводстве
Генетическая инженерия открыла небывалые ранее возможности по созданию принципиально новых микробиологических
продуцентов биологически активных веществ.
Так с помощью методов генной инженерии синтезирован ген,
кодирующий лимфотоксин – белок, убивающий опухолевые
клетки. Промышленное производство интерферона и иммуноглобулина, обладающих противовирусным действием, стало возможным благодаря успехам генной инженерии.
22

В бактерию кишечной палочки была внесена молекула ДНК,
кодирующая белок вируса ящура – болезни, поражающей крупный рогатый скот и приносящий огромные убытки животноводам. Сегменты ДНК, введенные в бактерию, стали продуцировать
белок вируса ящура, который используют для иммунизации животных.
Возможность встраивания участка ДНК млекопитающих в
ДНК бактерий кишечной палочки была использована для промышленного синтеза гормона поджелудочной железы инсулина,
гормона гипофиза соматотропина.
В настоящее время еще сохраняется большая потребность в
безопасных вакцинах, используемых в ветеринарии.
Путем микробиологического синтеза, основанного на выведении и использовании специальных штаммов микроорганизмов,
продуцирующих ту или иную аминокислоту, получают в промышленности кормовой белок, незаменимые аминокислоты – лизин, триптофан, метионин, треонин. Ведутся поиски микробилогического синтеза других незаменимых аминокислот.
Однако достижения генной инженерии надо использовать
разумно, не нарушая экологического равновесия в природе.
Произвольное изменение генетического материала способно
нарушить взаимоотношение всех видов живых организмов и может стать катастрофой для человечества.
1.3.5.1. Генетически модифицированные продукты
питания
Генетически модифицированные (трансгенные) продукты
питания представляют особый интерес. Сообщения о генетически
модифицированных растениях и полученных из них продуктах
питания появились в начале 90-х гг. В настоящее время генетическому изменению подвергается важнейшее растительное сырье, а
без использования растительного сырья получают лишь очень
немногие продукты.
Успехи в области генной инженерии позволяют получать
новые сорта растений (причем в течение всего 2-3 лет) с заданными свойствами. За счет встраивания генов, выделенных из одних организмов и несущих определенную генетическую информацию (например, устойчивость к заморозкам, гербицидам, бо-
23

лезням и паразитам, высокая урожайность, неполегаемость и др.)
в ДНК других, были получены растения, которые называют
трансгенными, т. е. с перемещенными генами.
В США в настоящее время насчитывается более 150 наименований генетически измененных продуктов, а площади в разных
странах, на которых произрастают трансгенные растения, составляют по разным оценкам от 10 до 25 млн га. Трансгенные растения выращивают в США, Канаде, Японии, Китае, Бразилии, Аргентине и многих других странах. Европейские государства занимают в этом отношении более жесткую позицию. По прогнозам мировой рынок трансгенных культур достигнет приблизительно 8 млрд долларов США к 2005 г. и 25 млрд долларов США
к 2010 г.
В настоящее время среди промышленно выращиваемых
трансгенных растений доля устойчивых к гербицидам составляет
71%, устойчивых к вредителям – 22%, устойчивых одновременно
и к гербицидам, и к вредителям – 7%, устойчивых к вирусным,
бактериальным и грибным болезням – менее 1%.
К трансгенным продуктам можно отнести генетически измененную сою, устойчивую к гербицидам. Как известно, соя используется для приготовления 30 000 пищевых продуктов: супов,
детского питания, картофельных чипсов, маргарина, салатных
соусов, рыбных консервов и др. Кроме сои, наибольшее распространение получили трансгенные помидоры, кукуруза, рис, картофель, клубника, а также генетически модифицированные
дрожжи и ферментные препараты, полученные из трансгенных
микроорганизмов.
Известны ферментные препараты, полученные из генетически модифицированных микроорганизмов. Основными ферментными препаратами, полученными методами генной инженерии,
являются: α-амилаза из В. stearothermophilus, экстрессированная в
В. subtilis; α-амилаза В. megaterium, экстрессированная в В.
subtilis; химозин А, полученный из штамма Е. coli К- 1 2, содержащего ген телячьего прохимозина А. Кроме того, при производстве глюкозного сиропа из кукурузного крахмала применяются
ферменты из генетически измененных бактерий. В Германии получены трансгенные пектиназы, используемые при производстве
соков и вин. Генная инженерия находит применение и в живот-
24

новодстве, влияя на рост и продуктивность сельскохозяйственных животных.
Возможны различные подходы к оценке генетически измененного сырья и готовых пищевых продуктов из него. Это можно
проиллюстрировать на примере трансгенной сои и продуктов ее
переработки (рис. 9).
Рис. 9. Возможные продукты переработки трансгенной сои
Из трансгенного сырья (х) при технологической переработке
(в зависимости от способа) можно получить продукты как содержащие (х), так и не содержащие (о) генетически измененные
компоненты. Например, из сои получают масло, которое может
быть трансгенным (х) или нет (о). Соответственно продукты при
изготовлении которых используется соевое масло, будут трансгенными (х) или обычными (о).
Безопасность генетически модифицированных продуктов
питания остается все еще под вопросом. Хотя нет конкретных
примеров серьезной экологической опасности трансгенных растений в природной среде, на сегодняшний день нет и не может
быть однозначного ответа на вопрос о возможной опасности отдаленных последствий таких продуктов, поскольку их потенциальная опасность не подвергается сомнению.
Очевидно одно – трансгенная продукция должна проходить
тщательную многофакторную проверку на безопасность и иметь
специальную маркировку. Однако и в этом пока больше вопросов, чем ответов.
Все большее число стран старается регламентировать продажу «новых» пищевых продуктов. Так, в законе, принятом Европарламентом, на упаковках нерафинированного масла и поп-
25

корна из генетически измененной кукурузы должна быть соответствующая маркировка, а на упаковке с крахмалом или полученным из него глюкозным сиропом подобная маркировка не
требуется. Маркировка не требуется на упаковке с рафинированным маслом или приготовленном на его основе майонезе. Полученный из генетически измененного яблока мусс или яблочный
сок должны нести соответствующую маркировку, а яблочный уксус – нет. Не фиксируется факт использования генетически измененного сырья при изготовлении лецитина и получении с его помощью шоколада и крема. Должны иметь соответствующую маркировку соевый шрот, белок, полученный из него, и готовые супы с данным белком. Корма для животных, полученные из шрота
генетически измененной сои, не маркируются.
В странах Евросоюза в настоящее время барьер перед генетически измененной пищей сломан, однако, к потребителю допускается пища, в которой обнаруживаются только следы генетических изменений (рис. 10).
Рис. 10. Потенциальные риски применения трансгенных культур
В России с 1 июля 1999 г. вступило в силу постановление
Министерства здравоохранения РФ «О порядке гигиенической
оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников». Согласно этому доку-
26

менту гигиеническая экспертиза пищевых продуктов и продовольственного сырья, а также компонентов (фрагментов) для их
производства, полученных из генетически модифицированных
источников, должна включать определение вносимой последовательности генов, маркерных генов антибиотиков, промотеров,
стабильности генетически модифицированных организмов на
протяжении нескольких поколений, а также санитарно-химические показатели качества и безопасности, результаты токсикологических исследований на лабораторных животных, оценку аллергенных свойств продукта, возможных мутагенных, канцерогенных и тератогенных эффектов. Кроме этого, обязательна технологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированного сырья органолептических свойств и
физико-химических параметров.
Успехи и возможности генной инженерии далеко не однозначно воспринимаются человеческим сообществом, причем
приоритеты неприятия время от времени изменяются. Вначале
общественное мнение было встревожено генетической модификацией кишечной палочки Е. соli. Предполагалось, что эти генетические трансформанты выйдут из-под контроля и станут причиной многих страшных заболеваний. К началу 90-х гг. XX в.,
когда оказалось, что эти страхи безосновательны, внимание переключилось на трансгенные растения. К этому времени большие
успехи в получении трансгенных сои, картофеля, кукурузы и
других сельскохозяйственных культур были достигнуты в США.
Преимущества устойчивых к сорнякам, насекомым и другим условиям окружающей среды растений были очевидны, однако потребление генно-инженерных растительных продуктов в США и
особенно в странах Западной Европы было ограничено из-за боязни отдаленных последствий воздействия генетически измененных продуктов питания. То же самое касается трансгенных животных с повышенным содержанием гормона роста – соматотропина. Можно полагать, что в основном эти опасения безосновательны, хотя бурно развивающиеся генно-инженерные исследования должны находиться под контролем сообщества ученых,
общественности и правительственных организаций.
27

2. НАУКА О ФЕРМЕНТАХ – ПРАКТИКЕ
Практическое использование достижений энзимологии
можно найти во всех областях деятельности человека, где речь
идет о живых существах. Это и медицина, и животноводство, и
растениеводство, и промышленная микробиология, и многие виды пищевой промышленности.
2.1. Ферменты в лечебной практике
В лечебной практике можно выделить три главных направления, где учению о ферментах принадлежит ведущая роль:
1) изучение болезней, причина которых лежит в недоста-
точности ферментов;
2) использование определения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях организма для диагностики различных заболеваний;
3) применение ферментных препаратов в качестве лекарственных средств.
Генетически обусловленные нарушения химической
структуры ферментов – причина болезней
Мы видим, какой сложный и высокосовершенный механизм передачи наследственной информации и биосинтеза белка существует в клетке. Время от времени в длинных цепях
ДНК, где записана вся информация о синтезе белков, вдруг появляются случайные замены: вместо одного нуклеотида становится другой, или выпадает вовсе. Такие изменения называются мутациями. Они возникают при физическом воздействии,
радиоактивном облучении, под действием мутагенов. Может
так случиться, что замена одного единственного нуклеотида в
структурном гене приведет к тому, что в кодируемом этим геном белке вместо одной аминокислоты появится другая, коренным образом меняющая качество белка, в частности, лишающая его ферментативных свойств. Может быть и так, что
нарушение нуклеотидной последовательности в определенном
месте ДНК вообще лишит клетку способности синтезировать
тот или иной фермент.
28

Нередки случаи, когда отсутствие или недостаточная активность того или иного фермента вызывает болезненные явления,
но не угрожает жизни.
Например, при недостатке в кишечнике фермента бетагалактозидазы, расщепляющего лактозу, наблюдается расстройство пищеварения. Дело в том, что молочный сахар – лактоза –
это дисахарид, состоящий из глюкозы и галактозы. Дисахариды в
кишечнике не всасываются, они должны быть предварительно
разложены на составные части. Отсутствие бета-галактозидазы
делает невозможным такое разложение лактозы и тем самым
препятствует ее усвоению.
Гораздо более тяжелым заболеванием, нередко приводящим к гибели новорожденных, является непереносимость простых углеводов – моносахаридов (галактозы и фруктозы).
Здесь речь идет уже не о нарушении всасывания (в кровь из
кишечника они всасываются легко), а о невозможности их
нормального обмена в клетках из-за отсутствия необходимых
ферментов. Непереносимость галактозы и непереносимость
фруктозы – это разные заболевания и в основе их лежит дефицит разных ферментов, но в обоих случаях накапливаются
фосфорилированные продукты – галактозо-1-фосфат и фруктозо-1-фосфат, избыточные концентрации которых ведут к глубокому нарушению обмена веществ.
Знание природы этих заболеваний дает в руки специалистов
простое средство их лечения. Достаточно исключить из рациона
субстраты отсутствующих ферментов, в приведенных примерах –
галактозу и фруктозу, как наступает быстрое и практически полное выздоровление.
Примерно у одного ребенка, из каждых 15 – 20 тысяч рождающихся на нашей планете, наблюдается слабоумие, известное
под названием фенилпировиноградной олигофрении. Выяснилось, что причина его – недостаток фермента фенилаланингидроксилазы, катализирующей превращение аминокислоты фенилаланина в тирозин:
29

ОН
СН2
СНNH2
COOH
Фенилаланин
Фенилаланингидроксилаза
СН2
СНNH2
COOH
Тирозин
Тирозин, отличающийся от фенилаланина лишь наличием
гидроксильной группы (ОН) в кольце, может вступать в самые
различные реакции обмена веществ, тогда как возможности фенилаланина весьма ограничены. Если он не переходит в тирозин,
то из него получаются вещества, близкие по строению к фенилпировиноградной кислоте. Вещества эти оказывают губительное
действие на развитие мозга и, если не принять необходимых мер,
то они влекут за собой развитие умственной отсталости – слабоумие:
Удалось разработать простой способ выявления этого де-
СООН – С = О СН2
Фенилпировиноградная кислота
фекта, основанный на том, что продукты обмена фенилаланина
выделяются с мочой и могут быть обнаружены по появлению сине-зеленой окраски в присутствии специального реактива. Многие болезни крови имеют своей причиной наследственный недостаток тех или иных ферментов. К таким болезням относятся некоторые формы малокровия, нарушения свертывания крови, сопровождающиеся опасной для жизни кровоточивостью, и др.
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]
