Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биохимия в животноводстве. Учебное пособие
.pdf
Трансляция
Трансляция включает следующие этапы: активация аминокислот, инициация, элонгация, терминация, посттрансляционный
процессинг.
Активация аминокислот происходит в цитоплазме клетки.
Сущность ее состоит в том, чтобы соединить аминокислоту со
своей тРНК. Но тРНК сама по себе соединяться со своей аминокислотой не может. Для этой цели в клетке имеются специальные
ферменты, которые выполняют роль «переводчиков», т. е. обеспечивают узнавание тРНК своей аминокислоты. Эти ферменты
называются амино-ацил-тРНК-синтетазами.
тРНК путем простой диффузии переносит аминокислоту к
рибосомам, где происходит сборка белка из аминокислот.
Инициация. мРНК связывается с малой субчастицей рибосомы в точке, рядом с 5'-концом РНК. В пределах субчастицы
умещаются только 2 кодона мРНК. Первым кодоном всегда являются АУГ- или ГУГ- инициирующие кодоны.
Элонгация. Наращивание полипептида на одну аминокислоту осуществляется в 3 этапа:
1) связывание аминоацил – тРНК;
2) образование полипептидной связи;
3) транслокация.
1. В рибосоме есть два участка связывания аминоацил -
тРНК: А-участок и П-участок. Инициирующие аминоацил - тРНК
могут связываться только с П - участком. Энергия затрачивается
от ГТФ. На первой стадии элонгации происходит связывание
аминоацил-тРНК с А-участком рибосомы (рисунок 4) за счет
комплементарного взаимодействия между антикодоном аминоацил - тРНК и кодоном мРНК.
2. На второй стадии элонгации образуется новая пептидная
связь между аминокислотами, чьи тРНК расположены в А- и Пучастках рибосомы.
Реакция образования пептидной связи катализируется пеп-
тидил-трансферазой.
3. Происходит перемещение рибосом вдоль мРНК по направлению к 3'-концу на один – кодон – транслокация, для этого
необходим белковый фактор – транслоказа. Пептидил – тРНК пе-
11
ремещается из А-участка в П-участок. Этапы 1, 2, 3 повторяются
в соответствии с информацией следующего кодона.
Терминация – окончание трансляции – зависит от присутствия в мРНК терминирующих кодонов (УАА, УГА, УАГ).
С помощью белковых терминирующих факторов происходит гидролиз эфирной связи между пептидным остатком и тРНК.
Из П-участка высвобождается «пустая» тРНК и рибосома
диссоциирует на субъединицы.
В клетке мРНК транслируется несколькими рибосомамиполисомой.
Рис. 4. Синтез белка в рибосомах (в рибосомах тРНК антикодоном
связана с кодоном мРНК, а акцепторным концом – с растущим
пептидом)
12
Таким образом, в процессе синтеза белка происходит преоб-
разование генетической информации, заложенной в последовательности нуклеотидов ДНК, в структуру молекулы и РНК, затем
синтезирование полипептидной цепи.
1.2.1. Механизм регуляции биосинтеза белка
Клетки живых организмов обладают способностью синтезировать огромное количество разнообразных белков. Синтез белка
регулируется внешними и внутренними факторами и условиями,
которые диктуют клетке синтез такого количества белка и такого
набора белков, которые необходимы для выполнения физиологических функций.
Общую теорию регуляции синтеза белка разработали французские ученые, лауреаты Нобелевской премии Ф. Жакоб и
Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или
«включению» генов как функционирующих единиц, к возможности
или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию на
синтез специфических белков. Эта теория, доказанная в опытах на
бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических
клетках механизмы регуляции синтеза белка, вероятнее всего, являются более сложными. У бактерий доказана индукция ферментов
при добавлении в питательную среду субстратов этих ферментов.
Добавление конечных продуктов реакции, образование которых
катализируется этими же ферментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых ферментов. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления
– индукция и репрессия – взаимосвязаны.
Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моно, в биосинтезе белка
у бактерий участвуют по крайней мере 3 типа генов: структурные
гены, ген-регулятор и ген-оператор. Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти
гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано, служит матрицей для биосинтеза белка. Регуляция синтеза белка путем индукции представлена на рисунке 5.
13
Рис. 5. Регуляция синтеза белка путем индукции (схема)
ГР – ген-регулятор; П – промотор; ГО – ген-оператор
Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом
для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена или структурных генов, регулируемых им. «Считывание» генетического кода начинается с промотора-участка ДНК, расположенного рядом с геном-оператором и являющегося точкой инициации для синтеза
мРНК. Синтезированную молекулу мРНК, кодирующую синтез
нескольких разных белков, принято называть полигенным транскриптом. Одиночный ген или группа структурных генов образует
оперон.
В свою очередь деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Структурные гены и ген-регулятор
расположены в разных участках цепи ДНК, поэтому связь между
ними по Ф. Жакоб и Ж. Моно осуществляется при помощи белкарепрессора. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка (рис. 6).
14
Рис. 6. Регуляция синтеза белка путем репрессии (схема)
Механизм описанной регуляции синтеза белка и взаимоот-
ношения репрессора со структурными генами были доказаны в
опытах с E. coli на примере синтеза β-галактозидазы (лактазы) –
фермента, расщепляющего молочный сахар на глюкозу и галактозу. Дикий штамм E. coli обычно растет на глюкозе. Если вместо
глюкозы в питательную среду добавить лактозу (новый источник
энергии и углерода), то штамм не будет расти, пока не будут синтезированы соответствующие ферменты (адаптивный синтез).
При поступлении в клетку лактозы (индуктор) молекулы ее связываются с белком-репрессором и блокируют связь между репрессором и геном-оператором. Ген-оператор и структурные гены при этом начинают снова функционировать и синтезировать
необходимую мРНК, которая «дает команду» рибосомам синте-
зировать β-галактозидазу. Одновременно ген-регулятор продолжает вырабатывать репрессор, но последний блокируется новыми
молекулами лактозы, поэтому синтез фермента не продолжается.
Как только молекулы лактозы будут полностью расщеплены, репрессор освобождается и, поступив в ДНК, связывает ген-
оператор и блокирует синтез мРНК, а следовательно, синтез β-галактозидазы в рибосомах.
Регуляция генной активности у высших организмов намного
сложнее, чем у бактерий. У эукариот наряду с регуляторными
процессами существуют системы регуляции организма как целого. В отличие от прокариот, у которых процессы транскрипции и
трансляции не разобщены во времени и пространстве, у эукариот
15
синтез РНК происходит в ядре клетки, а синтез белков – на рибосомах в цитоплазме.
Таким образом, в живых организмах существует единая белоксинтезирующая система. В нее входят: система нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), ферментативная система, полный набор – аминокислот, рибосомы, образующие полисому, макроэргические соединения (АТФ, ГТФ). Наследственная информация, содержащаяся
в ДНК, транскрибируется на молекулу иРНК, которая, перемещаясь через ядерную мембрану, выходит из ядра в цитоплазму, перенося генетическую информацию к полисоме для синтеза белковых
молекул, выполняющих самые разнообразные функции.
Знания о нуклеиновых кислотах и биосинтезе белка используются для разработки научно обоснованных рекомендаций по
содержанию домашних животных, профилактики и лечения различных болезней.
Селекция, гибридизация, выведение новых пород животных
– все это базируется на теоретических сведениях о нуклеиновых
кислотах и биосинтезе белка.
Появилось новое направление науки – генная инженерия,
которая дает возможность непосредственно вмешаться в генетический аппарат клетки и эффективно на него влиять.
1.3. Генная инженерия
Генная инженерия является новой методической ветвью молекулярной биологии, разрабатывающей методы направленного
изменения наследственности в результате изъятия отдельных генов и переноса их из одной клетки в другую. Иначе говоря, генная инженерия позволяет манипулировать генами, что дает возможность передавать генетическую информацию от одного организма другому, не родственному ему по генетическим свойствам.
1.3.1. Общие принципы клонирования генов
Согласно современной стратегии генетической инженерии
можно выделить 5 основных условий проведения генноинженерных исследований:
а) в молекулу ДНК, способную реплицироваться в клетке автономно от хромосом (плазмида или вирусная ДНК), in vitro ферментативно встраиваются фрагменты ДНК из любого источника;
16
б) получаемые при этом молекулы, которые будем называть
гибридными ДНК, вводят в чувствительные клетки;
в) в клетках гибридные молекулы ДНК реплицируются,
размножая в своем составе клонируемый фрагмент ДНК;
г) определенными методами селектируют клоны клеток и
вирусов, содержащих индивидуальные молекулы гибридных
ДНК;
д) выявленные гибридные молекулы ДНК подвергают разностороннему структурно-функциональному изучению. Особую
роль при этом играют высокоэффективные методы анализа последовательности нуклеотидов фрагментов ДНК.
Технология комбинированных ДНК дает возможность
встраивать ДНК и добиваться синтеза ДНК в промышленных количествах.
1.3.2. Ферменты генетической инженерии
Осуществлять рекомбинацию молекул ДНК in vitro (в пробирке) стало возможным лишь после открытия в конце 60-х начале 70-х годов ряда новых ферментов с уникальными свойствами, имеющих в качестве субстратов катализируемых ими реакций нуклеиновые кислоты, и в первую очередь ДНК. Поэтому
целесообразно кратко рассмотреть основные свойства некоторых
из этих ферментов.
Эндонуклеазы (рестриктазы) являются ферментами, кото-
рые используют практически во всех работах по клонированию
фрагментов ДНК с целью либо гидролиза исследуемой ДНК для
последующего клонирования образовавшихся фрагментов, либо
анализа структуры полученных в эксперименте гибридных ДНК.
Такое широкое использование этого класса ферментов обусловлено тем, что они взаимодействуют со специфическими последовательностями двухцепочечной ДНК.
ДНК-лигаза – центральный фермент в современной методологии рекомбинации молекул ДНК in vitro. Открыли его в 1967 г.
независимо в нескольких лабораториях. Было показано наличие
ДНК-лигазы в клетках Е. coli.
Другие ферменты, используемые в генной инженерии.
Кроме перечисленных в экспериментах по клонированию
фрагментов ДНК используется большой набор других ферментов.
17
К ним относятся: ДНК-полимераза, полинуклеотидкиназа, щелочная фосфатаза, метилазы, РНК-полимераза и др.
В совокупности перечисленные ферменты составляют биохимическую базу экспериментов по конструированию in vitro
гибридных молекул ДНК.
1.3.3. Методы конструирования гибридных молекул ДНК in vitro
В 1972 г. опубликована работа, в которой П. Берг с сотруд-
никами впервые описали получение in vitro гибридной молекулы,
состоящей из ДНК вируса SV40 и ДНК фага λdvgal. Гибридные
молекулы конструировали методом, получившим название кон-
некторного.
Принцип первого варианта этого метода (рис. 7) заключается в том, что к 3′-концам одного из рекомбинируемых in vitro
фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достраивали олгo (dA) – сегменты определенной
длины, а к концам другого фрагмента – олиго (dT) – сегменты
примерно такой же длины. При смешивании полученных таким
образом фрагментов формируются кольцевые структуры за счет
образования водородных связей между олго (dА)- и олиго(dT)последовательностями.
Данный метод обычно используют при клонировании ДНКкопий (кДНК) матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах.
Более простой и самый популярный метод получения in vitro гибридных молекул ДНК – рестриктазно-лигазный. Первые
гибридные ДНК получены этим методом в 1973 г. (рис. 8).
Суть его заключается в следующем:
а) рестриктаза специфически разрезает молекулы ДНК на
фрагменты, имеющие идентичные взаимокомплементарные липкие концы;
б) препараты различных молекул ДНК, гидрализованных
одной и той же рестриктазой, смешивают и при определенных
условиях липкие концы разных фрагментов ДНК реассоциируют
за счет комплементарного взаимодействия;
в) с помощью ДНК-лигазы происходит ковалентное объеди-
нение ассоциированных фрагментов ДНК.
18
Рис 7. Схема коннекторного метода
По описанной схеме in vitro могут быть ковалентно соединены два и более любых фрагментов ДНК, полученных при гидролизе одной и той же рестриктазой. Однако с помощью рестриктаз (по крайне мере, одного фермента) в каждом конкретном случае можно получить лишь специфический, строго определенный
набор фрагментов данной ДНК. Но затем получила распространение новая модификация рестриктазно-лигазного метода (смотри рис. 8), позволяющая достаточно просто рекомбинировать in
vitro практически любые фрагменты ДНК. Она включает:
а) пришивку лигазой фага Т4 «стык в стык» по тупым или
по липким концам коротких синтетических двухцепочечных сегментов к обоим концам фрагмента ДНК, который предполагают
рекомбинировать;
б) обработку определенной рестриктазой пришитых олигонуклеотидных дуплексов, содержащих места действия этого
фермента, в результате чего образуются липкие концы;
19
в) рекомбинацию in vitro полученного фермента с выбранными молекулами ДНК по обычной схеме рестриктазнолигазного метода.
Рис. 8. Схема рестриктазно-лигазного метода
Синтетические сегменты ДНК, содержащие в своем составе
последовательности, узнаваемые рестриктазами, получили название линкерных молекул. Использование линкерных молекул делает рестриктазно-лигазный метод рекомбинации фрагментов ДНК
in vitro универсальным, поскольку исходные фрагменты ДНК
можно получать самыми разными методами.
1.3.4. Введение молекул ДНК в клетки
Методы отбора гибридных клонов
Необходимый этап генноинженерного эксперимента – введение в клетки полученных in vitro гибридных молекул ДНК с
целью их размножения, селекции и выделения искомых клонов.
Введение в клетку нуклеиновой кислоты вируса с последующим образованием вирусного потомства называется транс-
фекцией. Эффективность трансфекции обычно выражается коли-
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]