41. Что такое проточная цитометрия. Какова ее роль в диагностике.

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний.. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом (наиболее часто изотиоцианат).

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т.п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

42. Строение иммуноглобулинов: н-цепи, l-цепи, j-цепь; домены, комплементарно-детерминированные (гипервариабельные) регионы (cdr). Каковы функции Fab-и Fc-фрагментов.

Все иммуноглобулины человека построены однотипно и состоят из двух идентичных тяжелых полипептидных цепей (Н-цепей, Heavy chains) и двух идентичных легких полипептидных цепей (L-цепей, Light chains), которые связаны между собой посредством ковалентных дисульфидных мостиков (-S-S-) .

Молекулярная масса Н-цепи –50 000 - 70 000,L-цепи – 20000-25000.

Н-цепи, независимо от класса иммуноглобулинов, могут быть связаны либо с каппа-, либо с лямбда-типом L-цепи. В соответствии с типом Н-цепи (g, a, m, d, e), существует пять классов иммуноглобулинов: Ig G, Ig M, Ig A, Ig D, Ig E. Каждый класс иммуноглобулинов обладает особыми свойствами и биологической активностью.

Каждая полипептидная L- и Н-цепь состоит из вариабельной области (V-области, VL и VH) и константной области (С-области, CL и СH) (Рис. 5-1).У каждой легкой цепи имеется одна V-область и одна С-область. У каждой тяжелой цепи имеется одна V-область и 3 или 4 гомологичные константные области. IgG, IgD, IgA имеют три константные области, Ig М, Ig E – 4 константные области.

Легкая цепь иммуноглобулинов образована 214 аминокислотными остатками. Первые 107 аминокислотных остатков формируют V-область, вторые 107 аминокислотных остатков (108-214) формируют С-область легкой цепи.

Тяжелая цепь IgG, IgD, IgA состоит из 450 аминокислотных остатков. V-область этих иммуноглобулинов образована 116 аминокислотными остатками, С-область включает около 334 аминокислотных остатков, ее гомологичные участки СН1, СН2, СНЗ состоят примерно из 100-110 аминокислотных остатков.

Так, обработка IgG папаином выявила, что антитело состоит из трех функциональных фрагментов: двух Fab-фрагментов (Fragment antigen binding) и одного Fc-фрагмента (Fragment crystalline). Fab-фрагмент имеет молекулярную массу 50 000, структурно и функционально моновалентен, способен связывать антиген. Fc-фрагмент имеет мол. массу

60 000, состоит из двух Н-цепей (Сg2, СgЗ доменов), связанных между собой дисульфидными связями. Fc-фрагмент обладает способностью связывать комплемент, а также взаимодействовать с иммунокомпетентными клетками, связывая с ними антитела. При расщеплении молекулы иммуноглобулина пепсином образуется 2 функциональных фрагмента: F(ab)2-фрагмент и pFc1-фрагмент. F(аb)2-фрагмент состоит из двух Fab-фрагментов связанных между собой дисульфидными мостиками. F(аb)2-фрагмент имеет молекулярную массу 100 000, двухвалентен, обладает во многом свойствами антитела (способен взаимодействовать с антигеном и преципитировать его); pFc1-фрагмент представляет собой С-концевую область Fc-фрагмента, состоит из С-концевых областей двух Н-цепей, которые соединены между собой нековалентными связями.