книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

дов, содержащих дезоксирибозу, фосфорилирование сахара воз­ можно только при С-3' и С-5', так как С-1' и С-4' включены в коль­ цо фуранозы, а С-2' не несет гидроксилыюй группы. С-2', С-З' и С-5'-изомеры РНК не подвергаются этерификации, исключение со­

дают смесь или 5'- или З'-нуклеотидов из ДНК и РНК, в то время как щелочной гидролиз РНК дает смесь 2'- и З'-нуклеотидов. Био­ логическая роль 5'-монофоефатов не ограничивается их участием в обмене нуклеиновых кислот; 5'-монофосфаты обнаружены также

Основными составляющими единицами нуклеиновой кислоты яв­ ляются нуклеотиды, начиная с димеров (динуклеотиды) и заканчи­ вая длинноцепочными высокомолекулярными полимерами—нукле­ иновыми кислотами. Повторяющейся единицей в этих соединениях

впоследовательности индивидуальных N-оснований в полимерной цепи. Это было продемонстрировано открытием генетического кода

влабораториях Холлея, Ниренберга и Ра Бандари.

В. Специфика колонок и используемого оборудования

Нуклеотиды, нуклеозиды, пуриновые и пиримидиновые основа­ ния— нелетучие полярные соединения, имеющие приемлемую рас­ творимость в водных растворах. Эти соединения способны ионизо­ ваться в водных растворах, хотя в каждом отдельном случае это зависит от температуры, рН и ионной силы среды водных раство­ ров. Все приведенные химические характеристики соединений ука­ занного типа позволяют предположить, что в данном случае наибо­ лее действенным способом разделения может бъ1ть ионообменная хроматография. Особенно важно, что степень ионизации зависит от трех переменных: температуры, рН и ионности среды. Далее мы покажем, как, используя эти параметры, можно предложить прак­ тически бесконечное число вариантов методики разделения любой данной смеси компонентов нуклеиновых кислот.

Все рассматриваемые в данной главе анализы проведены на вы­ пускаемых промышленностью приборах «Varian Aerograph», мо­ дель «LCS 1000» и «LCS 4100». Устройство прибора «LCS 100» и все приспособления к нему описаны в работах [1—3].

На хроматографические системы, предназначенные для разделе­ ния указанных соединений при высоком давлении, высокой скорости, высоком разрешении и с высокой чувствительностью, накладывается ряд ограничений. Разделяющие колонки должны иметь относи­ тельно малый диаметр, а ионообменные разделяющие материалы должны обеспечивать чрезвычайно быстрый массоперенос (как уже говорилось в гл. 1). Совершенный хроматограф должен иметь ма­ лый внутренний объем. Блок ввода пробы, детектор, соединения колонок, внутренние соединения и транспортные линии — все дол­ жно быть такого малого объема, чтобы не происходило смешения или перемешивания разделенных соединений. Применяемые при вы­ соких давлениях ионообменные материалы, кроме того, должны быть прочными.

Используемые при разделении нуклеотидов сильноосновные анионообменные смолы (а в случае нуклеозидов и оснований — силь­ нокислые катионообменные смолы) не разрушаются при давлении 180—300 атм. Кроме того, чтобы можно было обеспечить быстрый массоперенос и быстрое установление равновесия, частицы смолы должны иметь малый диаметр — от 3 до 20 мкм или в случае ионообменников пленочного типа — очень тонкий слой смолы. Быстрый массоперенос также увеличивает скорость регенерации по оконча­ нии разделения способом градиентного элюирования. В точности идентификации компонентов можно быть уверенным в том случае, если используемые смолы в течение длительного периода времени дают один и тот же удерживаемый объем для определенного соеди­ нения.

Детектор должен обладать высокой чувствительностью, чтобы можно было проводить определения с малыми пробами. Кроме

того, Детекторы должны иметь чрезвычайно высокую стабильность

и хорошо воспроизводить сигналы. При разделении составляющих нуклеиновых кислот целесообразнее всего использовать ультрафио­ летовый детектор. В рассматриваемых далее экспериментах приме­ нялся УФ-фотометр, работающий на длине волны 254 нм. Этот де­ тектор имеет высокую чувствительность, достаточную прочность и трудно загрязняется, так что чувствительность его не меняется в течение длительного периода времени. Молярная абсорбционная способность большинства соединений обсуждаемого класса лежит в пределах от 10 000 до 20 000. Соединения с абсорбционной спо­ собностью 10 000 могут быть легко определены при содержании

Ю- 6 моль/л.

Вкачестве подвижных фаз в этих исследованиях использова­ лись водные растворы однозамещенного фосфата калия и аммония, формиата аммония и ацетата натрия с рН от 2 до 7 и диапазоном концентраций буфера от 0,01 до 6,0 моль/л.

Колонки были изготовлены из трубок из нержавеющей стали длиной 300 см, наружный диаметр был равен 1,5 мм, внутренний 1 мм. Некоторые разделения проводились на колонках длиной 15 и 25 см с наружным диаметром 3 мм, внутренним диаметром 2,4 мм. В некоторых случаях первые 15 см колонки присоединялись к ос­ новной колонке с помощью соединения с «нулевым мертвым объе­ мом», и эту часть колонки можно было удалять. Применяя такие составные колонки, можно провести регенерацию той части колон­ ки, которая обычно загрязняется примесями, имеющими очень низ­ кую подвижность в разделительной системе. Эту часть колонки иногда называют «предколонкой», хотя она заполнена той же на­ садкой, что и основная колонка, и в действительности является со­ ставной частью разделительной колонки.

Как и в любом другом аналитическом методе, в жидкостной хро­ матографии одинаково важное значение имеют и правильность ме­ тодики, и талант экспериментатора. Поэтому нет ничего удивитель­ ного, что экспериментальные условия, которые дают идеальные результаты для одного анализа, иногда не подходят для другого подобного анализа. Например, заменяя одну партию ионообменной смолы на другую, иногда для достижения оптимальных результатов необходимо изменять условия хроматографирования. Хорваш [1], Узиел [4], Кох [5] и Бартиш [6—8] описали некоторые важные сооб­ ражения, которыми они руководствовались, определяя, какие пара­ метры необходимо регулировать для получения оптимальных результатов в описанных здесь разделениях. Как правило, приве­ денные ниже параметры следует изменять в том порядке, как они записаны. Хотя для достижения оптимальных результатов очень часто оказывается достаточным изменить только один параметр, в некоторых случаях бывает необходимо одновременно или последо­ вательно изменять два или более параметров.

/. рН буферных растворов. Может быть достаточным увеличение или уменьшение рН всего лишь на 0,10.

2.Температура колонки. Чтобы определить, нужно ли изменять температуру колонки и какое изменение (повышение или пониже­ ние) будет эффективным, достаточно повысить или понизить темпе­ ратуру колонки на 5°С по сравнению с первоначальной.

3.Ионная сила буферного раствора. Обычно достаточно увели­ чения или уменьшения ионной силы на 0,1 М или даже меньше. Ко­ лонки, заполненные пленочными ионообменными смолами, характе­ ризуются большой величиной отношения подвижной и неподвижной фаз, так что активность элюента в колонках, заполненных пленоч­ ными ионообменниками, может быть гораздо ниже, чем в колонках

собычными ионообменными смолами.

4.Программа градиентного элюирования. Эта методика чрез­ вычайно важна, так как благодаря своим большим потенциальным возможностям она одна может способствовать выбору правильных условий разделения данной смеси.

Поэтому для выявления эффекта скорость потока обычно снижает­ ся только на 20%. Это изменение будет также увеличивать чувстви­ тельность. Очевидно, снижение скорости потока приводит к пропор­ циональному увеличению длительности анализа.

6. Тип ионообменной смолы. Этот фактор может приводить к ко­ ренным изменениям в разрешении, но данный вопрос слишком сло­ жен, чтобы его стоило рассматривать в данном разделе.

Г. Экспериментальные изменения параметров

Рис. 12.1 — 12.5 иллюстрируют экспериментальное изменение не­ которых параметров, возможное в ионообменной колоночной хро­ матографии. На этих рисунках показано влияние на разделение нуклеозидов изменения диаметра частиц насадки, длины колонки, природы элюента и температуры.

На рис. 12.1 показано разделение пяти нуклеозидов (уридина, инозина, гуанозина, аденозина и цитидина) на колонке с сильнокис­ лой катионообменной смолой с диаметром частиц 7—10 мкм. Длина колонки 25 см и нереагирующие компоненты проходят через нее примерно за 50 с. Первый пик — уридин — вымывается через 50 с. Все пять нуклеозидов дают полностью разрешимые пики в течение 5 мин.

Рис. 12.2 демонстрирует влияние уменьшения диаметра частиц на разделение нуклеозидов. Эксперимецтальные условия здесь те же, что и. указанные на рис. 12.1, только диаметр частиц меньше: 3—7 мкм. В этих условиях те же самые пять нуклеозидов дают полностью разрешимые пики менее чем за 4 мин. Платить за такое увеличение скорости и эффективности приходится повышением дав­ ления.

306 Глава 12

На рис. 12.3 показано совместное влияние изменения длины ко­ лонки, скорости потока и температуры. Здесь применялись те же

тили с 25 до 15 см. Это привело к большей объемной скорости по­ тока при том же давлении на входе в колонку. Кроме того, темпе­

8 этих условиях смесь пяти нуклеозидов разделяется менее чем за

0,64 г

1 мин. Повышая температуру, мы ускоряем массоперенос, но те­ ряем в разрешении для первых четырех пиков из-за снижения в эф­ фективности колонки, связанной с работой на более короткой ко­ лонке при более высоких линейных скоростях элюента.

Разрешение часто можно повысить в результате изменения рН, как это показано на рис. 12.4. В данном случае используется та же

повысилось, но одновременно вследствие увеличения времени удер­ живания общее время разделения возросло с менее чем 1 до 2,5 мин.

Рис. 12.5 показывает другое изменение методики, позволяющее увеличить скорость разделения. В этом случае были использованы колонки с частицами смолы большего диаметра (10—14 мкм). Вследствие увеличения размера частиц носителя при том же номи­

Д. Анализы нуклеотидов

Анализы рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов можно проводить на сильноосновных анионообменных смолах. Поскольку эти нуклеотиды имеют родственную структуру, но значительно ме­ няются при ионизации, то, чтобы повысить разрешение колонки, рекомендуется использовать метод градиентного элюирования.

Итак, используя эту систему, можно достичь высокой скорости, вы­ сокого разрешения и высокой чувствительности. Разделение прово­

ния, в качестве стартового элюента использовался 0,01 М однозамещенный фосфат калия с рН 3,35. Для установления градиента 1,0 М раствор однозамещенного фосфата калия (рН 4,3) смешивали с стартовым раствором при объемной скорости потока 6 мл/ч. На­ чальный стартовый объем фосфатного буфера низкой концентрации составлял 50 мл, и ввод градиента осуществлялся через 7,5 мин после начала анализа (с момента ввода пробы). По окончании

Е. Анализ нуклеозидов и N-оснований

Во многих отношениях разделение нуклеозидов осуществляется проще, чем разделение нуклеотидов; об этом, в частности, говорит тот факт, что безградиентное элюирование нуклеозидов возможно

0,24

0,16

*:

о

со

0,08

0,0 . — у

Р и с . 12.8. Разделение моно-, ди- и трифосфатов.

даже для тех пар, которые трудно разрешить. Если цикл регенера­ ции (необходимый при градиентном элюировании) исключен, мо­ жно сократить время анализа. Нуклеозиды и рибозиды подобны по своим химическим характеристикам пуриновым и пиримидиновым основаниям, так как очень слабокислые карбогидратные замести­ тели оказывают только вторичный эффект на ионизацию собственно пуринов и пиримидинов, имеющих основной характер. Из-за отсут­ ствия фосфатных групп, обнаруженных в нуклеотидах, в случае