Задача 3.

1. 2. Лабораторная диагностика бруцеллеза

При диагностике бруцеллеза используют бактериологический, биологический и серологический методы, аллергическую пробу и полимеразную цепную реакцию (ПЦР)

В связи с высокой контагиозностью возбудителей, бактериологи­ческая диагностика, а также другие исследования с живыми бруцеллами, выполняются только в специальных лабораториях с соблюдением правил работы с особо опасными инфекциями.

Исследуемые материалы: кровь, моча, костный мозг, суставная жидкость, ликвор, желчь, испражнения, грудное молоко и др.

Бактериологическое исследование. Посевы осуществляют на жидкие и плотные питательные среды: печеночный бульон и печеноч­ный агар или мясопептонный бульон (МПБ) и мясопептонный агар (МПА) с добавлением 1% раствора глюкозы и 2% раствора глицерина или с асцитической жидкостью и другие среды. Посевы крови для по­лучения гемокультуры проводят, начиная с первой недели болезни, при отрицательном результате делают повторные высевы. Процент высева B.melitensis в остром периоде составляет 60-90%, В.abortus — 5-15%.

Стерильно взятую кровь больного (10 мл) вносят по 5 мл в 2 фла­кона со 100 мл печеночного бульона (или другой питательной среды). В одном из флаконов создают атмосферу 10% СО₂, что способствует вы­делению B.abortus. Учитывая замедленный рост бруцелл, посевы инку­бируют при 37°С в течение 30 дней. Через каждые 4-5 дней из обоих флаконов делают высевы на печеночный агар - для получения колоний возбудителя. Одновременно с жидкими средами исследуемую кровь за­севают непосредственно на плотную среду для ускорения исследований.

Хорошие результаты дают посевы костного мозга, которые вы­полняют аналогично. Миелокультуру удается получить в 2 раза чаще, чем гемокультуру, и не только в острый период, но и в более поздние сроки заболевания.

Исследуемые материалы, содержащие постороннюю микрофло­ру (мочу и др.) предварительно центрифугируют и затем засевают оса­док на плотную среду, в которую добавляют генциан-виолет (1:200000) для задержки роста грамположительных бактерий.

Ускорения и увеличения высеваемости бруцелл удается достичь при посеве исследуемого материала в желток свежих куриных яиц или в желточный мешок куриного эмбриона. Зараженные куриные эмбрионы выдерживают в термостате при 37°С 5 дней, после чего желтки высевают на плотные и жидкие среды с целью выделения чистой куль­туры возбудителя.

Биологический метод. Его используют для выделения возбуди­теля при отрицательном результате бактериологического исследова­ния. Метод заключается в заражении исследуемым материалом восприимчивых лабораторных животных - морских свинок или бе­лых мышей - подкожно или внутрибрюшинно. Через 20-25 дней жи­вотных забивают и проводят бактериологическое исследование: высевы из крови, печени, селезенки, лимфоузлов на чашки с печеночным ага­ром для выделения чистой культуры.

Идентификация выделенной культуры. Бруцеллы, патогенные для человека, обладают сходной морфологией, культуральными и био­химическими свойствами и способностью агглютинироваться диагно­стической противобруцеллезной сывороткой.

Для отличия бруцелл от других бактерий используют окраску мазков из испытуемой культура по способу Козловского. Мазки окра­шивают раствором сафранина (красного цвета) при подогревании, промывают водой, докрашивают раствором малахитового или бриллиантового зеленого и снова промывают водой. В результате ок­раски бруцеллы сохраняют красновато-розовый цвет, а остальные бак­терии приобретают зеленую окраску.

Испытуемая культура должна агглютинироваться диагностичес­кой противобруцеллезной сывороткой в реакции агглютинации на стек­ле (ориентировочной) и в развернутой реакции агглютинации с возрастающими разведениями сыворотки (до ее титра), причем агг­лютинация культуры должна достигать не менее 2/3 титра сыворотки. Хорошие результаты дает также прямая иммунофлюоресценция.

Если испытуемая культура обладает вышеперечисленными свой­ствами, ее относят к бруцеллам и у больного диагностируют бруцеллез. Установление вида и биовара бруцелл необходимо для эпидемио­логических целей и в определенной мере помогает прогнозировать течение заболевания. Для окончательной идентификации выделенной культуры проводят ее тестирование по комплексу дифференциальных признаков: потребность в СО₂, образование НД бактериостатическое действие анилиновых красителей тионина и фуксина, агглютинация монорецепторными сыворотками А и М, чувствительность к диагностическому фагу Тб, способность к метаболическому окислению неко­торых кислот и углеводов контроль антигена (0,03 диагностикума + 0,03 изотонического раство­ра NaCl). При положительной реакции во всех трех опытных дозах сыворотки или в дозах 0,02 и. 0,04 мл появляются хлопья, окрашенные в синий цвет. Реакцию Хеддльсона используют при массовых обсле­дованиях, например в бруцеллезном очаге. С сыворотками, давшими положительный результат, обязательно ставят реакцию Райта.

Реакция Райта - развернутая реакция агглютинации, которую проводят в пробирках с разведениями сыворотки от 1:50 до 1:800. Для разведения сыворотки используют изотонический раствор NaCl, в ко­торый добавлен фенол (0,5%) В качестве антигена берут единый бру­целлезный диагностикум, разведенный 1:10. Диагностический титр реакции Райта 1:200.

Более надежные результаты дает исследование парных сывороток, взятых с интервалом 7-10 дней, что позволяет выявить динамику выра­ботки антител (у вакцинированных титр сыворотки не изменяется).

Используют и другие серологические реакции - РНГА, обладаю­щую большей чувствительностью; РСК, которая становится положи­тельной через 3-4 недели после начала заболевания и длительно сохраняется; Непрямую РИФ, которая сохраняется во все периоды за­болевания; ИФА - рекомендован в качестве экспресс-метода при мас­совых обследованиях на бруцеллез.

Эти же серологические реакции возможно применять для выяв­ления возбудителей и/или их антигенов непосредственно в клиничес­ком материале, но только в условиях специализированной лаборатории.

Внутрикожная аллергическая проба Бюрне. Выявляет аллергизацию организма к бруцеллезу, становится положительной к концу первого месяца болезни и сохраняется в течение жизни, поэтому ее используют для распознавания различных форм бруцеллеза, в том числе и хронических. Пробу ставят на сгибательной поверхности предпле­чья, куда внутрикожно вводят 0,1 мл бруцеллина (фильтрат 3-х недель­ной бульонной культуры бруцелл). При положительной реакции через 24 часа на месте введения появляется гиперемия и отечность диамет­ром 3-6 см, при резко положительной реакции диаметр отека превы­шает 6 см. Положительный результат пробы Бюрне наблюдают и у вакцинированных людей.

В диагностике бруцеллеза успешно применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР).