2 курс / Биохимия / Книжки и сборники / Biokhimia_dlya_chaynikov

между цепями установлены дисульфидные связи, то для их разделения приме- няется процедура, описанная в следующем шаге.

Шаг 2. Разрыв дисульфидных связей внутри цепей

На этом шаге выполняется разрыв (расщепление) дисульфидных связей. За- дача решается обычным восстановлением. Однако связи впоследствии могут возобновиться, поэтому их нужно не только расщепить, но и предупредить их восстановление, проведя процедуру восстановительного расщепления с после-

дующим алкилированием. Обратный процесс предотвращает окислительное

расщепление, при котором сера окисляется до -SO3 .

Шаг 3. Определение концентрации аминокислотв цепи

Эта задача легко выполняется с помощью аминокислотного анализатора —

автоматического инструмента, который определяет набор аминокислот в белке меньше, чем за один час. Для работы ему требуется меньше одного наномоля белка. Анализатор выдает процентное содержание каждой присутствующей в белке аминокислоты. Однако он определяет только состав белка, а не порядок соединения аминокислот.

Шаг 4. Определение концевых аминокислот

На этом этапе можно не только определить концевые аминокислоты, но и

узнать, присутствует ли в белке больше одной цепи. У полипептидной цепи

есть всего одна N-концевая и одна С-концевая аминокислота. Следовательно, при определении более одной N- или С-концевых аминокислот делается вы-

вод, что в белке больше одной полипептидной цепи.

Вы можете определить N-концевой остаток разными путями. В общем

случае процедуру начинают, добавляя реагент, который вступает в реакцию с

N-концевой аминокислотой и помечает ее. Последующий гидролиз разруша-

ет полипептид, позволяя провести разделение и идентификацию помеченных

остатков. В этом методе применяют реагент Зангера, дансилхлорид и лейци-

наминопептидазу. На сегодняшний день эта задача выполняется с помощью метода расщепления по Эдману. Подобно другим методам в нем помечаются N-концевые остатки, однако только концевые аминокислоты отщепляются от

цепи, поскольку оставшаяся часть не разрушается, как в других методах. Про-

цедуру можно повторить на укороченной цепи, чтобы определить следующий

остаток. В принципе, повторение расщепления по Эдману может указать всю

последовательность, но в большинстве случаев пределом является определе-

ние первых 30-60 остатков.

Подобным образом можно также определить С-концевой остаток. Для этих целей выполняются реакции Акабори (гидразинолиз) и восстановления с литиево-алюминиевым гидридом. Кроме того для выборочного отщепления

102 ЧАСТЬ 2 Фундамент биохимии: белки

сыворотки, помеченные как онти-А и онти-В. Добавление капли одной из них в образец крови вызывает коагуляцию,если в этом образце присутствует соответствующий антиген. Сыворотка анти-А взаимодействует с антигенами крови типов А и АВ.Сыворотка анти-В вступает в реакцию с антигенами крови

типов В и АВ.Ни одна из сывороток не взаимодействует с типом 0.Приблизи- тельное распространение типов крови имеетследующий вид:43-45% — тип 0, 10-12% — тип В и 3-5% — тип АВ.Кроме того, выделяются подгруппы с обо- значениями 01 и 02, а также определяются другие, очень редкие типы крови.

Резус-фактор (Rh) выступает дополнительным критерием типизации крови. Он (название заимствовано у одного из видов обезьян) представляет собой

антиген на поверхности красных кровяных телец. У людей с положительным резус-фактором в крови встречается белок (антитело), который исходно был

обнаружен в крови макаки-резус.Около 85% людей являются резус положи- тельными.А те, у которых такого белка нет, считаются резус отрицательными.

Оценка образцов крови как резус положительных или резус отрицательных имеет важное практическое применение. Существует около 30 возможных

комбинаций факторов.

Дополнительные критерии позволяют определить, принадлежала ли кровь

конкретному человеку, — для этого проводится идентификация ферментов

и белков, находящихся в крови.Судебный эксперт (см. врезку "Судебная экс-

пертиза: анализ пятен крови" выше) проводит такое исследование в каждом случае, когда позволяет качество образцов.Одна из отличительных характе-

ристик белков и ферментов крови — этополиморфизмили способность суще-

ствования в видеизоферментов;другимисловами,белок можетпредставлять- ся в разнообразных формах и видах.Один хорошо известный пример — это

полиморфизм гемоглобина, который вызывает серповидно-клеточную ане- мию.Среди широко известных полиморфизмов следующие соединения.

На сегодняшнийдень хорошо исследована распространенность каждой их по- лиморфных форм среди людей. Определение каждого из возможных допол-

нительных факторов позволяет сузить область дальнейшего расследования.

104 ЧАСТЬ 2 Фундамент биохимии: белки

Глава 6

Ферментативная кинетика:ускоряемся

»Классификация ферментов

»Кинетика ферментов

»Ингибирование и регуляция

ерменты — это комплекс биологических молекул, состоящих в Основ- S. 1 Ш ном или полностью из белка, которые ведут себя как биологический

катализатор. Как катализаторы они увеличивают скорость протека-

ния химической реакции без непосредственного участия в ней. Чаще всего

ферменты сильно ограничены областью действия, нацеливаясь только на опре-

деленные специфически реагирующие вещества, называемые субстратами.

Такое поведение ферментов зачастую определяется стереоспецифично-

стью — расположением атомов субстрата в определенном порядке в трехмер-

ном пространстве. Стереоспецифичность проявляется в том, что если, напри-

мер, заменить D-глюкозу на ее энантомер, L-глюкозу, то мы с вами не могли бы усваивать его вместе с остальными продуктами питания. (Обязательно узнай-

те, что представляет собой раствор глюкозы, предназначенный для внутривен-

ного введения!)

Ферменты существуют во многих формах. Некоторые ферменты состоят полностью из белков, в то время как у других есть небелковые части, назы- ваемые кофакторами. Кофактором может выступать ион металла, например магния, или органическое вещество. Органический кофактор называется ко- энзимом (у металлического кофактора специального названия нет). Фермент