ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.6. Органогенез в культуре соматических тканей

Сомаклоны, у которых проявляется генетическая изменчивость, отно-

сят к сомаклональным вариантам.

Приняты следующие обозначения для растений-регенерантов или, соответственно, для сомаклонов и их самоопыленных потомков:

R – растение-регенерант; R1 R2 и т. д. – первое, второе и последующие самоопыленные поколения растения-регенеранта;

SC – сомаклон; SC1, SC2 и т. д. – первое, второе и последующие самоопыленные поколения сомаклона.

Сомаклональная изменчивость характеризуется высокой частотой мутирования. По данным корпорации DNA Plant Technology (США), до 15 % регенерированных в культуре тканей растений томатов имели в потомстве генетические изменения. При исследовании числа хромосом у растенийрегенерантов различных сортов пшеницы структурные изменения хромосом обнаружены примерно у 25 % регенерировавших растений.

Сомаклональные изменения наследуются и связаны с простыми генными мутациями. Однако в настоящее время неизвестен конкретный генетический механизм, приводящий к нестабильности культивируемых клеток. В различных исследованиях обнаружены многочисленные кариологические нарушения у регенерантов – полиплоидия, анеуплоидия, фрагментирование хромосом, хромосомные мосты, транслокации, делеции, инверсии, многочисленные хромосомные аберрации.

Условия in vitro являются стрессом для культивируемых клеток и тканей. Это связано с изоляцией от целого организма его фрагментов и помещением их в новые условия.

В процессе культивирования наблюдается цитогенетическая и генетическая гетерогенность клеточных культур, что определяется:

–клеточной гетерогенностью исходных эксплантов, связанной с уровнем их полисоматии (миксоплоидии);

–условиями культивирования, где ведущая роль в индуцировании клеточной изменчивости принадлежит фитогормонам.

Вследствие этого растения, регенерировавшие в условиях in vitro из развивающихся соматических эмбриоидов или из стеблевых почек, могут характеризоваться фенотипической и генетической изменчивостью.

Так, спектр фенотипического разнообразия у растений-регенерантов более выражен, чем у их потомков, полученных после самоопыления. Это связано с физиологическими нарушениями, происходящими в процессе культивирования на искусственной питательной среде и приводящими к подавлению роста и развития растений, снижению их фертильности. Например, у регенерантов ячменя и пшеницы можно наблюдать формирование сдвоенных колосьев, супротивно расположенных листьев. Такие нарушения, как правило, не наследуются.

На основании изучения сомаклонов выявлены следующие механизмы,

которые могут объяснить сомаклональную изменчивость:

1) грубые кариологические нарушения (изменения числа хромосом – полиплоидия, анеуплоидия; хромосомные перестройки – транслокации, де-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.6. Органогенез в культуре соматических тканей

леции, инверсии, дупликации), которые хорошо определяются цитологическими методами анализа;

2)хромосомные перестройки, не выявляемые при цитологическом анализе и квалифицируемые как точковые мутации;

3)соматический (митотический) кроссинговер и обмен сестринских хроматид (наиболее хорошо изучено у томатов);

4)изменчивость цитоплазматических геномов;

5)амплификация и редукция генов;

6)активация ранее репрессированных (молчащих) генов;

7)активация мобильных элементов (изучено у отдельных моделей – люцерны, табака, кукурузы) [11].

Таким образом, под термином «сомаклональная изменчивость» пони-

мают разнообразный спектр генетической, цитогенетической, молекулярной изменчивости, обусловленный изменениями в ядерном или цитоплазматических геномах в результате культивирования in vitro.

Выявлено несколько причин генетической нестабильности культивируемых клеток. В большинстве случаев генетической основой сомаклональной изменчивости являются мутации единичных или небольшой группы генов доминирующего или рецессивного характера в ядерном, пластидном или митохондриальном геномах [12, 14]. Другой причиной может являться длительное пассирование тканевых и клеточных культур, приводящее к накоплению в них генетических изменений.

Каждый из указанных выше механизмов, обусловливающих изменчивость у сомаклонов, в определенной степени связан с другими и зависит от нарушений клеточного цикла, которые индуцируются действием фитогормонов, содержащихся в культуральной среде [5, 11, 13].

Экспериментально установлены следующие закономерности:

1.Регенеранты, развившиеся в результате непрямого эмбриогенеза или органогенеза, характеризуются большей изменчивостью, чем регенеранты, полученные в результате прямого эмбриогенеза или органогенеза.

2.С длительностью культивирования частота сомаклональной изменчивости у регенировавших растений увеличивается.

3.Степень изменчивости по частоте цитогенетических нарушений у сомаклонов определяется жизнеспособностью растений.

Для выявления у сомаклонов изменений в виде точковых мутаций производят их скрещивание с исходными линиями и прослеживают расщепление

вряду поколений.

Значительная часть сомаклональной изменчивости у мягкой пшеницы, томатов, риса обусловлена стабильными генетическими изменениями следующего характера:

– у сомаклонов мягкой пшеницы и риса, например, выявлены изменения по биохимическим и морфологическим признакам, находящиеся под моногенным (состав глиадинов, цвет зерновок) и полигенным (высота растений, сроки колошения, урожайность) генетическим контролем;

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.6.Органогенез в культуре соматических тканей

–сомаклоны могут иметь изменения по ряду признаков, которые в потомстве группируются независимо;

–мутации у сомаклонов могут быть рецессивными, доминантными, кодоминантными;

–мутации, обнаруженные у сомаклонов мягкой пшеницы, могут затрагивать гены, локализованные во всех семи гомеологических группах хромосом мягкой пшеницы;

–у сомаклонов томатов обнаружены новые генные мутации, ранее не индуцированные в результате химического или радиционного мутагенеза;

–одиночные генные мутации у сомаклонов могут проявляться с отно-

сительно высокой частотой (в среднем в одном растении на каждые 20 –25 растений-регенерантов).

Изменчивость митохондриального генома обнаружена у сомаклонов разных растений. Наиболее хорошо это явление изучено у растений кукурузы, регенерировавших из каллусной ткани незрелых зародышей. Анализ митохондриальной ДНК показал, что в структуре мт-ДНК сомаклонов произошли изменения, которые определяли их высокую чувствительность к грибу Helminthosporium maydis и которые не были выявлены у растений семенных поколений.

Примером изменчивости пластидного генома, вызванной его делециями, служат многочисленные данные по получению альбиносов среди сомаклонов пшеницы, риса, ячменя, сорго, кукурузы.

Амплификация (увеличение дозы гена, приводящее к возрастанию количества соответствующего фермента) описана в клетках суспензионной культуры люцерны. Была выделена клеточная линия, которую по сравнению с исходной характеризовала более высокая устойчивость к гербициду фосфинотрицину.

Таким образом, сомаклональную изменчивость можно рассматривать как один из источников увеличения генетического разнообразия растений.

4.6.4. Гормоннезависимыерастительныеткани

Ткани, образованные «привыкшими» клетками, которые приобретают способность расти без гормонов (становятся автономными по отношению к экзогенным цитокининам и ауксинам), называются гормоннезависимыми. Еще их называют химическими опухолями. «Привыкшие» ткани, как и опухолевые, в большинстве случаев не способны к нормальной регенерации и образуют лишь тератомы, хотя в отдельных случаях формируются и регенеранты. В таких тканях, как и в опухолевых, наблюдается интенсивный синтез собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во внесении их в питательную среду.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.6. Органогенез в культуре соматических тканей

Кроме «привыкших» тканей существуют опухоли растительного происхождения, вызванные бактериями, вирусами, а также генетические опухоли, возникающие на межвидовых гибридах различных растений. Наиболее распространенными в природе и представляющими интерес для исследователей являются корончатые галлы-опухоли, индуцированные у двудомный растений агробактериями (Agrobacterium tumefaciens). Часто встречаются еще два вида истинных опухолей у растений – бородатый корень (Agrobacterium rhizogenes) и стеблевой галл (Agrobacterium rubi), сходный с корончатым галлом [3, 8, 12].

Общим свойством химических и природных опухолей растений является их гормоннезависимость. Внешне и те, и другие ткани сходны с каллусными. У «привыкших» тканей гормоннезависмость достигается в результате изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков, участвующих в построении молекул гормонов, следовательно, в конечном счете отвечающих за синтез гормонов. Таким образом, изменения в данном случае носят эпигенный характер, хотя нельзя исключить и возможность мутации.

Вопухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс.

В40-х гг. Браун показал, что ткани корончато-галловой опухоли даже в отсутствие агробактерий (например, после гибели под воздействием высоких температур) сохраняют опухолевые свойства. На искусственной среде эти ткани продолжают активно пролиферировать. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и продуцируют несколько цитокининов.

В1977 г. Чилтон показал, что опухоли корончатого галла возникают в результате включения определенного фрагмента Ти-плазмиды (Т-ДНК) агробактерий в растительную ядерную ДНК. Таким образом, сегмент Типлазмиды интегрируется в хромосому и становится частью наследственного аппарата трансформированной (опухолевой) растительной клетки. Гормоннезависимость, являющаяся следствием экспрессии генов, контролирующих синтез ауксинов и цитокининов, приводит к дедифференцировке и пролиферации клеток. Путь синтеза этих гормонов в опухолевых клетках более простой и короткий, чем в нормальных и «привыкших» клетках.

Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует синтез галлами нового класса веществ, не встречающихся в природе, – опинов. Они содержатся только в тканях корончатых галлов и служат их маркерами. Они являются ростовыми веществами агробактерий, однако опухоли продуцируют их

ив отсутствие микроорганизмов.

Общие свойства «привыкших» и опухолевых клеток: гормоннезависимость и отсутствие регенерации.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.7. Суспензионныекультуры

Суспензию клеток можно получить из каллуса при помещении его в жидкую питательную среду на качалку или непосредственно из ткани экспланта с помощью пектиназы и встряхивания. Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате образуется клеточная суспензия [11, 14].

Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60–100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100–120 об/мин.

Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, который легко фрагментируется на отдельные клетки или небольшие агрегаты и получается на средах с 2,4-Д. Облегчает суспендирование исключение из питательной среды ионов кальция, цитокининов или уменьшение их концентрации и увеличение ауксинов. Еще более – добавление в среду пектиназы, которая разрушает пектат кальция, склеивающий между собой отдельные клетки

Основным условием культивирования клеточных суспензий является постоянное встряхивание или перемешивание среды. Иначе опять формируется каллусная ткань! Деление поддерживается присутствием ауксинов и цитокининов, которые необходимы для индукции и роста каллусной ткани.

Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 сут. Обычно длительность культивирования составляет 14–16 дней. При этом плотность возрастает от 10 000 до 1 000 000 кл/мл. Для субкультивирования суспензия берется в конце экспоненциальной фазы, метаболиты – лучше в стационарной.

Назначение суспензий – получение вторичных метаболитов (лекарства, парфюмерия, биомасса, селекция и протопласты). Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве [2, 3, 8].

Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.7. Суспензионные культуры

Характеристики суспензии – жизнеспособность, плотность в суспензии, степень агрегированности, скорость роста.

По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14–16 дней после начала культивирования). При построении кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2-3 недели культивирования возрастает в 20 раз.

В зависимости от целей исследования условия культивирования и состав питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии преобладала определенная фракция клеток. Обычно в суспензии различают 4 основные фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты, средние агрегаты, крупные агрегаты.

При работе с суспензиями необходимо учитывать и ее жизнеспособность. О жизнеспособности клеток можно судить по движению цитоплазмы, по степени проницаемости клеточной стенки для красителей, по активности ферментов.

Жизнеспособность определяется по окрашиванию метиленовой синью или синей Эванса (0,5 %-м раствором синей Эванса или 0,01 %-м раствором флуоресцеинацетата). Прижизненные красители клетки не убивают и через оболочки живых клеток в цитоплазму не проникают. Жизнеспособность культуры определяют соотношением количества жизнеспособных клеток к общему количеству в миллилитре суспензии. Жизнеспособные или живые культуры характеризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при окрашивании препаратов красителями [11].

Суспензия считается жизнеспособной, если более 70 % клеток не окрашиваются в синий цвет; агрегат жизнеспособен, если более 50 % его клеток не окрасились.

Культивирование суспензий осуществляется в периодическом или непрерывном (проточном) режиме. Клетки не удаляются в закрытой системе, частично удаляются – в открытой. Для промышленного производства применяют ферментеры.

Во многих случаях изучение особенностей размножения и роста клеток связано с необходимостью использования синхронизированных клеточных популяций.

Как правило, клеточная популяция суспензионных культур не только гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки, различающиеся по времени вхождения в митоз. Для синхронизации клеточных культур используют методы индукции, когда течение клеточного цикла блокируется в определенном периоде под влиянием или физических факторов, например, пониженной температурой, или химических соединений.

Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых клеток могут быть ингибиторы синтеза ДНК: тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина. В результате обработки клеток этими веществами клеточный цикл про-

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.7. Суспензионные культуры

должается только до Gi-периода и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу клеток к синтезу ДНК, а затем и делению.

Другой способ синхронизации заключается в создании условий «голодания» по одному из компонентов культуральной среды, например, ауксину, цитокинину, углеводам, азоту. Клетки накапливаются в Giили Ог-периоде клеточного цикла. Затем пассирование суспензии на среду с недостающим компонентом приводит к синхронизации клеточного деления. С помощью индукции синхронизации клеточных делений удается повысить митотический индекс с 2-3 до 30–35 %.

4.8. Культураотдельныхизолированныхклеток, иликультураодиночныхклеток

Получение культуры отдельных изолированных клеток очень ценно для генетических и физиологических исследований, практического использования в клеточной селекции. Так, получение клона потомства одиночной клетки помогает установить причины генетической неоднородности каллусных клеток.

Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, тканей растений, из каллусных тканей или культуры протопластов после восстановления клеточной стенки. Для получения одиночных клеток иногда достаточно отстаивания суспензионной культуры (10–15 мин в колбе) или использования мацерирующих ферментов, центрифугирования в градиенте сахарозы либо фильтрования через сито.

Первые работы по изоляции клеток растений и получению изолированных клонов было выполнено в 1954 г. в Висконсинском университете, США. Отдельные клетки выделяли из рыхлой каллусной ткани табака, культивированной в жидкой питательной среде при постоянном встряхивании на шейкере. Трудности связаны с тем, что отдельные клетки не делятся в тех условиях, при которых растет каллусная ткань. Предварительные эксперименты показали, что при помещении отдельной изолированной клетки в культуральную среду ее деления не происходило.

Однако клоны из таких клеток удалось получить Мьюиру с соавторами с использованием метода ткани-«няньки». В этом случае изолированную клетку переносили на фильтровальную бумагу, смоченную питательной средой и помещенную на поверхность хорошо растущей каллусной ткани. Каллусная ткань индуцировала и поддерживала деление клетки, а затем и развитие клеточного клона. В тех же целях используют суспензионные культуры клеток [12] (рис. 4.14).

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток

Рис. 4.14. Использование в качестве «няньки» культуры суспензионных клеток при выращивании одиночных клеток: 1 – колонии клеток; 2 – фильтровальная бумага; 3 – алюминиевая сетка; 4 – пенополиуретан; 5– суспензия клеток

Для индукции клеточных делений одиночных клеток можно использовать кормящий слой (активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений), отделенный от культивируемых одиночных клеток полупроницаемой мембраной.

Стимулирует клеточное деление и кондиционирование среды, для чего в нее добавляют питательную среду интенсивно делящейся культуры клеток. Кондиционирующий фактор получают при фильтровании клеточной суспензии в экспоненциальной фазе роста через бактериальный фильтр.

Позже был разработан метод массового культивирования отдельных изолированных клеток – метод плейтинга (от the plate – чашка) [11]. Метод состоит из следующих процедур:

–получение клеточной суспензии в жидкой питательной среде из хорошо растущей каллусной ткани;

–фильтрование суспензии через сито для удаления крупных клеточных агрегатов;

–приготовление 0,6–1 %-й агаровой среды того же состава, который был использован для поддержания роста суспензии;

–нагревание агаровой среды до жидкого состояния и перемешивание

еес равным количеством суспензии, которую необходимо разлить в чашки Петри слоем около 1 мм;

–определение местоположения отдельных клеток с использованием инвертированного микроскопа и нанесение пометок об их наличии на крышках чашек;

–культивирование в темноте при t = 25 °С;

–наблюдения за развитием одноклеточных клонов.

В экспериментах Бергмана около 20 % изолированных каллусных клеток табака делилось и образовывало колонии.

При данном способе культивирования, даже при недостаточно сбалансированном составе питательной среды, может происходить деление отдельных клеток. Это обусловлено тем, что в соседних колониях, образованных из мелких клеточных агрегатов, синтезируются ростовые вещества, которые выделяются в среду и стимулируют клеточное деление.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток

Метод микрокамеры разработан Джонсом в 1960 г., который может быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной среды для культивирования отдельной изолированной клетки.

Метод включает следующие процедуры:

–на предметное стекло с помощью парафинового масла на небольшом расстоянии наклеивают два покровных стекла;

–между покровными стеклами наносят квадрат из парафинового масла;

–в камеру из парафинового масла помещают каплю питательной среды

сизолированной клеткой;

–сверху камеру накрывают третьим покровным стеклом;

–за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом. Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдеб-

рандту в 1965 г. продемонстрировать возможность получения из изолированной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения растения. Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотентность клетки растения. К указанному методу близок способ Ю.Ю. Глеба – в микрокаплях.

4.9. Культурапротопластов

Протопласт – клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Протопласт имеет характерную сферическую форму, его поверхность защищена только плазмолеммой.

4.9.1. Изоляцияпротопластов

Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ [11]. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:

–невысокая производительность;

–возможность использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом;

–трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов – энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 г. Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 г. Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.9. Культура протопластов

По сравнению с механическим энзиматический метод обладает следующими преимуществами:

–одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн из грамма ткани или клеток);

–клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу;

–клетки не повреждаются;

–метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

1)обработка ферментами;

2)выделение протопластов из клеточных стенок;

3)отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

В зависимости от происхождения растения и взятой для изоляции протопластов ткани подбирается вид ферментов, их комбинация и концентрация. Для выделения протопластов используют разные ткани растения, а также каллусные и суспензионные культуры. С целью получения большого числа однотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт «голый», один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3–0,8 моль/л. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур [12]. Лучше всего – в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.