Современные проблемы и методы биотехнологии

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

Тотипотентность теоретически постулирована клеточной теорией, сформулированной в независимых работах Шлейдена (1838), проведенных на растительных объектах, и Шванна (1839) – на растительных и животных объектах.

Классические эксперименты были выполнены немецкими ботаниками Фёхтингом (1878) и Рехингером (1893). Фехтинг выявил наличие полярности у изолированных (даже очень тонких) фрагментов стеблей, которые во влажных условиях формировали в апикальной части почки, а в базальной – каллус или корни. Рехингер определил, что даже минимальные размеры эксплантов способны продуцировать почки и регенерировать целые растения, однако этот размер ограничен. При культивировании фрагментов из почек тополя и ясеня, из корней свеклы и турнепса на поверхности сырого песка он показал, что с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм (не более чем 21-клеточный слой) способность к регенерации перестает проявляться.

Термин «тотипотентность» как способность растительных клеток к регенерации был введен Гебелем (1902), подтвердившим своими экспериментами результаты Фёхтинга.

Описанные эксперименты относят к культивированию изолированных тканей. И первой поддерживающей основой твердой среды был песок, а в качестве питательного компонента использовали воду. Однако для успешного воспроизводства методов культивирования in vitro необходимо использование многокомпонентных искусственных питательных сред и соблюдение асептических условий.

Впервые такой подход был применен Габерландтом (1902). В качестве питательной среды им был взят раствор минеральных солей по Кнопу, используемый с 1865 г. для песчаных культур, с добавлением источника углеводов сахарозы.

Вместе с тем для своих экспериментов Габерландт в качестве эксплантов использовал только высокоспециализированные клетки (тычиночные волоски традесканции, железистые волоски медуницы и крапивы, клетки сердцевины черешков водного гиацинта, замыкающие клетки устьиц лилейных, палисадные клетки из листьев яснотки). В условиях культивирования такие клетки оставались живыми в течение месяца, увеличивали размер, изменяли форму, накапливали крахмал, но их деления не происходило. Это было связано не только с высокой специализацией клеток, но и с отсутствием в питательной среде веществ, способных индуцировать клеточное деление. Габерландт писал, что у изолированных для культивирования тканей отсутствуют стимулы, исходящие от целого организма или его частей.

Следует отметить, что в начале века успехов добились зоологи, работавшие в области культивирования тканей животных. Благодаря работам Гаррисона (1907), Карреля (1911) и других исследователей была создана методика выращивания тканей животных на питательных средах природного происхождения (плазме крови, зародышевой жидкости).

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

Выполненные в те годы работы по культивированию изолированных тканей растений на экстрактах из растительных тканей не были продуктивными. Лишь значительно позже, в 40–50-е гг., при использовании жидкого эндосперма кокосового ореха – кокосового молока, было показано, что растительные экстракты могут оказывать стимулирующее действие на рост изолированных органов и тканей в условиях культивирования, но только при их добавлении к основному составу синтетических сред.

На фоне временных неудач по культивированию изолированных тканей и клеток растений с начала века получил развитие метод культуры изолированных зародышей, широко используемый в настоящее время для решения многих задач биологии и биотехнологии. В 1904 г. Ханниг провел успешную серию экспериментов по культивированию уже в асептических условиях практически зрелых изолированных зародышей крестоцветных на растворе минеральных солей и сахарозы. Однако зародыши, изолированные из незрелых семян, в этих условиях не дифференцировались.

Практическое применение культуры изолированных зародышей для преодоления несовместимости при отдаленной гибридизации было продемонстрировано работами Лайбаха (1925). Он вычленял зародыши из нежизнеспособных гибридных семян льна, завязавшихся в результате скрещивания двух видов Linum perenne x Linum austriacum, и культивировал их на фильтровальной бумаге или вате, смоченных раствором сахарозы. В результате были выращены гибридные растения.

В Германии Котти (1922) и в США Роббинс (1922) постулировали необходимость использования для культивирования меристематических клеток, изолированных из кончиков корней или почек, более сложных по составу культуральных сред с добавлением аминокислот и дрожжевого экстракта.

Эти подходы были удачно реализованы в 30-е гг. в работах американского исследователя Филиппа Уайта и французского исследователя Роже Готре, которых принято считать родоначальниками современных методов культивирования изолированных органов и тканей растений. Успех работ Уайта и Готре был определен оптимальным сочетанием объектов культивирования и состава питательных сред.

Серия работ Уайта (1934) была посвящена выращиванию изолированных корней томатов, которые при периодических пересадках (пассировании) отрезками кончиков корней на свежую среду могли расти неограниченно долго.

Другое направление работ Уайта связано с изучением опухолей растений, для чего был использован метод культивирования изолированных тканей.

Большое значение имеют работы Уайта (1939; 1941), посвященные разработке составов питательных сред. Среда Уайта, содержащая наряду со смесью минеральных солей и витамины, в настоящее время широко используется для выращивания тканей многих культур. При культивировании ткани табака на этой среде впервые удалось наблюдать спонтанное развитие зачатков стеблевых почек и формирование побегов.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

Основные объекты культивирования в работах Готре – камбиальная ткань стебля древесных и травянистых растений, ткань корнеплодов и клубней. В основе минерального состава среды была использована питательная смесь Кнопа. Готре заменил жидкую среду на твердую – агаровую и ввел в

состав культуральных сред фитогормон ауксин – индолилуксусную кислоту (ИУК). Наличие этих компонентов в среде способствует длительной пролиферации культивируемых каллусных тканей. В работах Готре каллусная ткань, индуцированная из камбия, могла продолжать развитие в течение 18 месяцев.

После появления работ Р. Готре и Ф. Уайта метод культуры изолированных тканей растений начал быстро развиваться во многих странах. Вводили в культуру все новые и новые виды растений.

Ауксины были открыты в 20-е гг. как факторы тропизмов растений. Природный ауксин в растениях представлен в основном в виде р-индолил-3- уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК. Этот фитогормон был открыт в 1926 г. Вентом. В начале 30-х гг. Ф. Кегль выделил его в чистом виде и уст а- новил химическое строение. В 60-е гг. был выделен второй представитель этого класса фитогормонов – фенилуксусная кислота (ФУК).

Другой класс фитогормонов – цитокинины – открыли в 1955 г. Скуг и Миллер, изучая рост каллуса сердцевинной паренхимы табака. Путем щелочного гидролиза ДНК животного происхождения они получили кинетин, который оказался способным вместе с ауксином стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы и камбия табака. На среде с ИУК без кинетина клетки не делились. В дальнейшем различные концентрации и соотношения цитокининов и ауксинов стали использоваться для каллусогенеза и индукции морфогенеза вкультуре изолированных тканей растений.

В 1957 г. впервые индуцирован морфогенез в культуре каллусной ткани моркови и получены растения-регенераты. Успех достигнут благодаря работам Бутенко и Стеварда. Огромная заслуга в развитии биотехнологических работ в нашей стране принадлежит Р.Г. Бутенко из Института физиологии растений РАН. Вместе со своими сотрудниками она создала мощную школу по культуральным работам у растений, что значительно расширило возможности по реконструкции, именно генома растений [4, 6].

В 1959 г. Никел и Тулик создали метод выделения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а вслед за этим Джонсон (1960), Павловай и Бутенко (1969) разработали метод культивирования отдельной клетки с помощью ткани-няньки.

В 1959 г. французский ученый Ж. Морель предложил метод культивирования изолированных меристем, который он использовал для микроразмножения орхидей. Еще ранее этим же методом он получил безвирусные растения картофеля. В нашей стране работы по микроразмножению меристемным методом на гербере были выполнены в Институте физиологии АН

СССР под руководством Р.Г. Бутенко (1960, 1964).

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.1.Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений

В1960 г. английским профессором Коккингом были впервые получены

сиспользованием ферментов изолированные протопласты и разработаны условия для их культивирования. Через 10 лет, в 1970 г., в той же лаборатории Пауэр с сотрудниками осуществили искусственное слияние протопластов и таким образом открыли путь к созданию соматических гибридов.

В1964 г. индийские ученые Гуха и Магешвари индуцировали андрогенез в культуре пыльников и использовали этот метод для получения гаплоидных растений.

В1971 г. Загорска и другими впервые получены, изучены и описаны сомаклональные варианты табака.

Таким образом, открытие самой возможности роста клеток вне организма и регенерации из них растений, а также веществ, стимулирующих этот процесс (фитогормонов), создало предпосылки для повышения эффективности растениеводства и селекции растений, а также новых возможностей использования растений (промышленное производство БАВ, съедобные вакцины и др.).

Наибольшее распространение в практике в настоящее время имеют результаты исследований по тканевой и клеточной биотехнологии. Клетки и ткани растений, выращиваемые на искусственных питательных средах в стерильных условиях (в стекле), называют культурой изолированных тканей.

4.2. Условияиметодыкультивирования тканейin vitro

Любая ткань растений – это сообщество клеток, и если она изолирована (выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей (клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения их полноценного питания и развития. Тогда при строгом соблюдении этих условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации ее генетической информации. Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий), можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут быть исходным материалом для селекции.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2.Условия и методы культивирования тканей in vitro

4.2.1.Составпитательныхсред

ирольихотдельныхкомпонентов

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы – в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.) [12].

В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды.

Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар (0,7–1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Обычная его концентрация – 8–10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани. Вместо агара можно использовать биогели.

Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6.

Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения.

Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10–3 М. Наиболее значимы из нихазот, фосфор, натрий, калий,магний, кальций исера.

Микроэлементы составляют в среде концентрации 10–6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы.

Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстано- вительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор.

Органические составляющие сред. Согласно многочисленным дан-

ным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2.Условия и методы культивирования тканей in vitro

Вкачестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина – источник аминокислот.

Вкультуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин.

Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы – токсичны, L-формы – пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде.

Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию.

Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл.

При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар.

При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться.

Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани, взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде. При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара. Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани.

Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2–5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур (травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

глюкозой. На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3 культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений.

В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей.

Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды.

Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается образование веществ, стимулирующих рост тканей.

так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света также сказываются на углеводном метаболизме тканей.

Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые.

В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами. По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже.

Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно.

Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды.

Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1, табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов [12, 14].

Таблица 4.1

Примеры составов наиболее употребляемых питательных сред для культивирования растительных клеток тканей

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

Продолжение табл. 4.1

В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток. Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro

Продолжение табл. 4.2

МС – самая универсальная среда, пригодная для образования и роста каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

4.2.2. Гормоныирегуляторыроста– необходимые компонентыпитательныхсред

Помимо источников углерода, азота и других минеральных компонентов, среда для культивирования тканей многоклеточных организмов, таких как растения, должна содержать специфические стимуляторы и регуляторы роста: фитогормоны или их синтетические аналоги [11]. Известно около

5 тыс. соединений, обладающих регуляторной активностью, однако на практике применяется лишь несколько десятков.

Известны три класса фитогормонов, действующих преимущественно как стимуляторы (ауксины, гибберелины, цитокинины), и два класса фитогормонов, оказывающих главным образом ингибирующее действие (абсцизовая кислота, этилен).

Ауксины – производные аминокислот: ИУК – триптофана, ФУК – фенилаланина. Природный ауксин в растениях встречается в основном в виде β-индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК, второй представитель этого класса фитогормонов — фенилуксусная кислота, однако его роль в фиторегуляции значительно меньше ИУК.