Физико-химические методы стимуляции выхода мирацидия из яиц трематод

Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздействием на яйца трематоды специальной реакционной среды в сочетании с последовательными приемами – созданием перепада температур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.

Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предварительно охлаждают до 10-12⁰С. Все последующие операции осуществляют при комнатной температуре (18-22⁰С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержащей 100-400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5-10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осторожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробирку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного светового микроскопа (×200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка активно выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3-5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красителем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчитывают мирацидии.

Приготовление реакционной среды

Среду готовят на 0,05М трис-HCl буфере в оптимальных режимах рН 8,0-9,5. В буфер добавляют этанол до 10-13% и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах рН) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50000). Можно использовать и другой буфер, работающий в щелочных пределах рН, например 0,05Мфосфатный (рН 8,5). Следовательно, среда содержит 96% этанол – 12 частей; краситель (маточный раствор) – 1-10 частей; 0,05М трис-HCl буфер (рН 8,5-9,5) – до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96% этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей - 0,05М трис-HCl буфер, рН 9,5.

Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Герман, Беэра, Стратана

Каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц трематоды, помещают в цетрифужную пробирку на 1-2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипеткой 1-2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28-30⁰С 2-3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4% раствора хлорида натрия или 0,3% раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (18-22⁰С), при этом каждые 25-30 мин (по мере подсыхания) добавляют по 1-2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллированной воде. После этого препарат микроскопируют при 100-200 кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу раскрывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3-7% губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30-40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5- 0,5%). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1- 0,5% (или хлорида калия в концентрации 0,05 - 0,4%) обусловливает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких прозрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окрашивания и подсчета мирацидиев.