2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdfГлава 3 |
Основы энзимологии |
|
|
|
|
Раствор субстрата нового фуксина (рекомендуется для срезов ткани)
1. |
Раствор A: смешать 18 мл 0,2 M 2-амино- |
|
40 мг в 1 мл дистиллированной воды). |
|
2-метил-1,3-пропанедиола (Merck 801464) с |
|
Встряхивать в течение 60 секунд. |
|
50 мл 0,05 M Трис-буфера (pH 9,7) и 600 мг |
4. |
Смешать растворы А и В, затем добав- |
|
натрия хлорида. Добавить 28 мг левами- |
||
|
|
ляют раствор С; довести значение рН до |
|
|
зола (Sigma L 9756) |
|
|
|
|
8,7 с помощью HCl. Хорошо перемешать и |
|
|
|
|
|
2. |
Раствор B: растворить 35 мг нафтол |
|
фильтровать на срезы. |
|
AS-BI фосфата (Sigma N2250) в 0,42 мл |
5. |
Инкубировать в течение 10-20 минут при |
|
N,N-диметилформамида. |
||
|
|
комнатной температуре. |
|
|
|
|
|
3. |
Раствор C: под вытяжным шкафом |
6. |
Промыть в дистиллированной воде. |
|
смешать 0,14 мл 5% раствора нового |
||
|
|
|
|
|
фуксина (Sigma N 0638, 5 г в 100 мл 2 N |
7. |
Выполнить контрастное окрашивание и заклю- |
|
HCI) с 0,35 мл свежеприготовленного 4% |
|
чить срез под покровное стекло с использова- |
|
раствора натрия нитрита (Sigma S2252, |
|
нием органической или водной среды. |
Раствор субстрата нового фуксина (альтернативная процедура)
1.Раствор A: в вытяжном шкафу добавить 0,2 мл 5% нового фуксина (Merck 4041, в 2N HCI) к 0,5 мл свежего 4% натрия нитрита. Встряхнуть в течение 30-60 секунд. Добавить 100 мл 0,05 М Трисбуфера (рН 8,7) и 100 мкл 1 М левамизола, чтобы заблокировать эндогенную щелочную фосфатазу.
2.Раствор В: растворить 50 мг нафтол AS-BI фосфата (Sigma N2250) в 0,6 мл N,N-диметилформамида.
3.Добавить раствор В к раствору A и хорошо перемешать. Фильтровать непосредственно на срезы.
4.Инкубировать в течение 10-20 минут при комнатной температуре.
5.Промыть в дистиллированной воде.
6.Выполнить контрастное окрашивание и заключить срез под покровное стекло с использованием органической или водной среды.
Литература:
1.Sternberger LA. Immunocytochemistry (2nd ed). – New York: Wiley, 1979.
2.Mason DY et al. // J Cancer Res Clin Oncol. – 1981. –
101.– p.13-22.
3.Cordell JLet al // J Histochem Cytochem. – 1984. –
32.– p. 219-229.
4.Ponder BA and Wilkinson MM // J Histochem Cytochem. – 1981. – 29. – p. 981-984.
5.Gown AM In DeLellis RA (ed) // Advances in Immunohistochemistry. – New York: Raven Press, 1988. – p. 31-45.
6.Newman GR et al. // J Microscopy. – 1983. – 132. – RР 1-2.
7.Dako Specifi cations, numbers K0597, K0598, K0599, K0624 and K0698.
8.Dako Specifi cations numbers K3461, K3465 andK3467.
9.Newman GR et al. // J Microscopy. – 1983. – 132. – RP1-2.
10.Clark CA et al. J. // J Histochem Cytochem. – 1982. – 30. – p. 27-34.
11.Gayetal // J Histochem Cytochem. – 1984. – 324. – p. 47-51.
12.BondiAetal. // Histochemistry. – 1982. – 76. – p. 153-158.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 39
Глава 4 | Стандартизация иммуногистохимических методов
Thomas Boenisch MS
перевод Н.М. Гайфуллина
Введение и история вопроса: достижение консенсуса в вопросе стандартизации
С самого начала имелось беспокойство, связанное с относительно плохой воспроизводимостью результатов иммуногистохимических (IHC) методов применительно к фиксированным формалином и залитым в парафин (FFPE) препаратам тканей, воспроизводимостью результатов в пределах одной лаборатории в разные дни и воспроизводимостью результатов в разных лабораториях. В последние годы эти тревоги, пожалуй, усилились, при этом отсутствие стандартизации в настоящее время признается основным препятствием для проведения фундаментальных исследований, клинических испытаний и контроля за лечением пациента. За последние три десятилетия был проведен ряд конференций, целью которых было поставить этот вопрос и найти конструктивные решения проблемы. Среди самых эффективных следует упомянуть ряд встреч в начале 1990-х гг., спонсированных комиссией по биологическим красителям и FDA (управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств), итогом которых стало создание рекомендаций для производителей, относительно точное описание и валидация качества IHC реагентов [1]. Кроме того, по итогам встреч подчеркива-
Таблица 4.1.
ДИЗАЙН ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ* ОКРАСКА, ОРГАНИЗОВАННАЯ ТАК ЖЕ СТРОГО, КАК И КЛИНИЧЕСКИЙ ЛАБОРАТОРНЫЙ АНАЛИЗ
Преаналитическая фаза Выбор исследования
Тип пробы
Получение, время до фиксации / время транспортировки
Фиксация, тип и общее время
Обработка, температура
Аналитическая фаза
Процедура демаскировки антигена
Выбор первичных антител
Протокол: реагенты для мечения
Валидация качества реагента
Выбор контроля
Обучение / сертификация специалиста
Сертификация лаборатории / программы QA (гарантии качества)
Постаналитическая фаза
Оценка эффективности контроля
Описание результатов
Интерпретация/оповещение
Патологоанатом – опыт и специальная подготовка, специфичные для IHС
*по CR Taylor [2, 3, 5] с дополнениями.
40 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 4 |
Стандартизация иммуногистохимических методов |
|
|
|
|
лась необходимость уделить внимание всем аспектам процедуры IHС исследования. Последние рекомендации, заимствованные из значительно более строгих протоколов, которые распространяются на иммунологические анализы в клинических лабораториях, приняты за основу дизайна исследования (табл. 4.1.) [2, 3]. На проведенном позднее собрании с участием приглашенных экспертов, FDA и NIST (Национальный институт стандартов и технологии) преимущественно обсуждались вопросы стандартизации иммуногистохимических анализов Her2 и необходимости разработки универсальных контрольных материалов (эталонных стандартов) [4].
На этих собраниях был достигнут консенсус относительно того, что переход методов IHC «от лабораторных исследований до клинической практики» в смысле использования в обычной хирургической биопсийной патологии, был значительно затруднен двумя ключевыми факторами. Прошли десятилетия, а эти проблемы остались нерешенными.
1.Улучшилось качество реагентов для IHC, однако увеличилось количество источников реагентов и разнообразие методов окраски. Это многообразие в значительной степени способствует отсутствию стандартизации. Данная проблема теоретически решается использованием хорошей техники и надлежащих контролей, однако на практике это требует такого мастерства в технологическом процессе, что многие лаборатории не могут найти достаточно квалифицированных сотрудников для удовлетворения этих требований.
2.Стандартным методом приготовления образца ткани остается фиксация формалином и заливка в парафин (FFPE). Этот очень старый подход может быть приемлем для сохранения морфологических деталей, однако он отрицательно влияет на антигенность молекулмишеней в ткани до неизвестных степеней. Огромные различия протоколов (включая время фиксации), использованных для FFPE ткани, в разных лабораториях или в пределах одной лаборатории при исследовании разных образцов, остается проблемой и способствует плохой воспроизводимости результатов.
Множество исследователей и многие производители рассмотрели различные аспекты проблемы, концентрируясь на лучшей фиксации ткани, более эффективных методах демаскировки антигенов, улучшении реагентов, более чувствительных методах детекции и разработке эталонных стандартов или контролей [2-8]. К настоящему времени эти пути решения проблемы не привели к разработке общей системы IHC, которая бы обеспечивала стабильное высокое качество с достаточным уровнем воспроизводимости и надежности результатов, чтобы получить возможность надежно сравнить результаты IHC разных лабораторий, особенно в случаях проведения полуколичественных исследований (как для Her2 или ER) [4, 7, 8].
Возможно сделать некоторые выводы:
•В ближайшее время не ожидается решения проблемы стандартизации пробоподготовки; научные аспекты разработки нового фиксатора, заменившего бы формалин, являются затруднительными и, что важнее, имеются огромные материально-технические и экономические препятствия для отказа от формалина по всему миру.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 41
Стандартизация иммуногистохимических методов |
Глава 4 |
|
|
|
|
•Реагенты высокого качества с высоко чувствительными методами детекции доступны, однако они должны применяться надлежащим образом с необходимым контролем, что в настоящее время часто не выполняется.
•Имеется острая необходимость тканевых контролей IHC (или «эталонных стандартов») [4, 7, 8], которые могли бы стать доступными для всех лабораторий, выполняющих IHC анализы. Эти контроли до некоторой степени сходны с «универсальными эталонными или калибровочными стандартами», которые доступны для клинических лабораторий, выполняющих исследование ELISA, которое, в принципе, является аналогичной методикой (те же реагенты, которые используются при иммуноферментном твердофазном анализе (ELISA) для измерения уровня инсулина в сыворотке крови, могут быть использованы для выполнения IHC окраски парафиновых срезов на инсулин).
Из этого короткого обсуждения следует, что для максимальной стандартизации всем лабораториям следует проводить IHC анализ одинаковым образом на каждом этапе исследования, то есть использовать одинаковый фиксатор и время фиксации, одинаковую процедуру демаскировка антигена, одинаковые первичные антитела и системы детекции, пользоваться услугами одного постав-
щика, использовать одинаковые автоматические приборы для окрашивания и одинаковые контроли. Очевидно, что этот прекрасный вариант никогда не осуществится, поэтому мы должны сделать все что можем для того, чтобы улучшить последствия изменений параметров процесса.
Готовые к использованию реагенты
В настоящей главе внимание уделяется применению готовых к использованию (RTU) реагентов, иногда также называемых «предварительно разведенными реагентами» или наборами для IHC. Возможное преимущество RTU будет изучено в отношении улучшения стандартизации методов IHC, включая косвенные преимущества, связанные с приготовлением пробы, а также использованием и
доступностью контрольных тканей.
Вдизайне исследования (табл. 4.1.) действия, перечисленные в рубрике «аналитическая фаза», имеют особое значение в IHC лаборатории, поскольку их надлежащее выполнение является прямой ответственностью руководителя лаборатории и персонала, включая лаборантов и патологоанатомов. Безусловно, проблемы «преаналитической фазы» и «постаналитической фазы» имеют большое значение и должны рассматриваться в контексте общей эффективности, однако IHC лаборатория несет ответственность за эффективность окраски или анализа IHC.
Вто время как это может показаться чем-то вроде семантики, автор убедился, что то, как рассматривается IHC (как «окраска» или как «анализ»), играет важную роль в установлении надлежащего образа мышления персонала лаборатории и патологоанатомов. Метод IHC многими считается просто «окраской», который приводит к образованию видимой цветной реакции в срезе ткани. Тем не менее, IHC не должна считаться просто другой «специальной окраской», такой как PAS-реакция или серебрение. Как уже было указано, IHC по существу является методом ELISA, примененным на
срезе ткани. В этом отношении IHC (при надлежащем выполнении) может работать как воспроизво-
42 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 4 |
Стандартизация иммуногистохимических методов |
|
|
|
|
димый количественный анализ ELISA ткани, что значительно больше, чем просто окраска. То, что метод IHC главным образом не доходит до этого уровня, является следствием ошибок при выполнении
метода, особенно непостоянства способов приготовления пробы, отсутствия эталонного или калибровочного стандартов и неудовлетворительной валидации качества реагентов [7, 8]. Использование RTU реагентов окончательно не решает эти проблемы, однако по причинам, которые будут обсуждаться ниже, может привести к повышению воспроизводимости и последовательности результатов в практическом смысле, в значительной степени за счет навязывания пользователю лаборатории
использования внешних стандартов, внешней валидации качества реагента и определенных, широко исследованных протоколов.
Валидация качества реагента
Выбор и валидация качества реагентов для использования в IHC прямо не определяются. Большинство процедур IHC, использующихся в настоящее время при морфологической диагностике, включает множество этапов. Первичное антитело является ключевым первым компонентом, обеспечивающим специфичность мишени при исследовании. Первичное антитело само по себе не содержит метки, и его локализация на срезе визуализируется косвенно посредством последующего нанесения вторичных реагентов, несущих метку. Это требует оптимизации содержания множества реагентов при их совместном использовании целесообразным и документально подтвержденным образом, что способствует достижению контроля и воспроизводимости результатов.
Первичное антитело, выбор, валидация и оптимизация
Первичное антитело придает методу IHC специфичность и может быть получено как в виде концентрата антител, так и в виде RTU реагента. При работе с концентратом раствор антител необходимо довести до оптимального рабочего разведения, чтобы в дальнейшем использовать его со вторичной системой мечения, выбранной лабораторией. При использовании RTU реагента антитела,
как правило, приобретаются вместе с оптимальной системой мечения и установленным протоколом для выполнения анализа в автостейнере или ручными методами.
Приступая к выполнению исследования IHC (анализ, окраска) и при выборе антител, имеющих требуемую специфичность (за исключением случаев, когда они готовятся de novo на месте), необходимо исходить из описаний, данных производителем(ями) в каталогах, листках-вкладышах или данных о продажах. Опыт автора решительно поддерживает мнение о том, что лучшая гарантия надлежащей специфичности и получения хороших результатов заключается в использовании продукта(ов) от производителей, которые проверены временем; в приобретении реагентов у поставщиков, с хорошей
репутацией, и у тех, у которых лаборатория в прошлом уже приобретала реагенты, дающие стабильно надежные результаты. Однако и в таком случае ответственность за подтверждение функциональной специфичности всех без исключения реагентов с использованием соответствующих материалов положительного и отрицательного контроля (см. ниже) лежит на лаборатории, выполняющей исследование. Данное утверждение в равной степени распространяется как на гарантии специфичности первичного антитела, так и на все реагенты, задействованные в протоколе (см. табл. 4.1., анали-
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 43
Стандартизация иммуногистохимических методов |
Глава 4 |
|
|
|
|
тическая фаза). Кроме того, требование о проведении валидации специфичности относится ко всем антителам, независимо от того, были ли они получены в концентрированной форме и разведены в лаборатории или использовались в виде RTU реагентов. Разница заключается в том, что проводить валидацию специфичности RTU реагентов легче, о чем пойдет речь позднее.
Колоссальное разнообразие реагентов для IHC исследования и большое количество различных продавцов этих реагентов в некотором смысле способствует отсутствию стандартизации. Фактически имеется слишком большой выбор. Как описано в главе 1, первичные антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Поликлональные антитела, или антисыворотка, производятся с использованием традиционных методов иммунизации с бустер-инъекциями для повышения реактивности против антигена-мишени. Такая антисыворотка фактически содержит множество различных видов антител с разной специфичностью для многих антигенов, однако в ней значительно больше антител к интересующим антигенам-мишеням, обладающим высокой аффинностью к нему (антитела к другим антигенам, не представляющим интерес, содержатся в низкой концентрации, или имеют низкую аффинность, или их количество может быть избирательно уменьшено методами истощения). Моноклональные антитела, приготовленные гибридом или с помощью молекулярной инженерии, содержат один вид молекулы антитела, где все молекулы антитела идентичны по идиотипу, имеют одинаковую специфичность и аффинность.
Таким образом, в растворе моноклональных антител концентрацию активных специфичных молекул антител можно узнать и точно измерить, однако это значение не может быть больше, чем оцененная концентрация поликлональных антител (антисыворотки). Это связано с тем, что в последней представлено множество различных молекул. Концентрация моноклональных антител может быть точно определена производителем в пг/мл или мг/л, а рабочие разведения (в лаборатории) затем могут быть представлены, например, в мкг/л, хотя часто приводится простая пропорция разведения в виде 1:50, 1:100 и т.п. Для поликлональных антител (антисыворотки) точная концентрация
«активных специфических молекул антитела» (состав по весу) предоставить нельзя, и рабочие разведения выражаются в виде пропорций разведения (1:50, 1:100 и т.п.) первичной антисыворотки, предоставленной производителем. Поликлональные антитела одинаковой заявленной специфичности заметно отличаются у разных производителей, как может различаться концентрация моноклональных реагентов (даже если они из одного клона) и их абсолютная специфичность, определяемая эпитопом, с которым они связываются. Процесс выбора рабочего разведения приводит к значительным различиям фактической концентрации специфических антител в разных лабораториях, отличающихся по источнику поставки, а также по точности (или ее отсутствию) серийных титрований, используемых для достижения оптимальной концентрации (см. ниже). RTU реагенты могут быть поликлональными или моноклональными и предварительно разводятся производителем под строгим контролем качества с использованием определенной системы мечения и определенного протокола, чтобы продемонстрировать получение стабильных результатов при исследовании на выбранных клетках и тканях положительного (и отрицательного) контроля. Концентрация антитела (по массе) для RTU реагентов обычно не приводятся (даже если они моноклональные), поскольку подразумевается, что реагент
должен быть использован сразу без дополнительного разведения. Фактически, RTU реагенты по
44 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 4 |
Стандартизация иммуногистохимических методов |
|
|
|
|
определению не должны подвергаться дополнительному разведению в лаборатории, выполняющей анализ. Кроме того, не должны изменяться рекомендованная система детекции или любой из этапов
окрашивания, а также протокол мечения. Любое изменение требует проведения в лаборатории, выполняющей анализ, обширной повторной валидации качества всей системы.
Как отмечено выше, реагенты как поликлональных, так и моноклональных антител, должны быть добавлены на срез ткани в оптимальной концентрации или рабочем разведении, которое определяется как разведение, при котором наблюдается наибольшая интенсивность специфической
реакции с минимальным уровнем неспецифической фоновой окраски, то есть наибольшее соотношение сигнала и шума. Для RTU реагентов рабочее разведение заранее определяется производителем на основании обширных внутренних исследований, что освобождает лабораторию, выполняющую анализ, от этой работы. Для антител, которые поставляются в концентрированной форме, оптимальная концентрация (или рабочее разведение) определяется экспериментально в каждой лаборатории с помощью исследований методом серийного титрования (для получения подробной информации см. главу 2 и Taylor CR et al. [5]). Поскольку первичные антитела сами по себе обычно не несут метку, необходимо исследовать связь различных рабочих разведений первичного антитела с рабочими разведениями реагента для мечения (или вторичного антитела) с помощью так называемого титрования методом «шахматной доски» (см. главу 2 и Taylor CR et al. [5]). Это комплексный процесс, требующий навыка в выполнении разведений растворов белка, с самого начала имеющих очень низкие концентрации (в порядке мг/л), в котором незначительные ошибки в технике разведения могут привести к многократным изменениям фактической концентрации антитела после серийного разведения, приводя к значительным изменениям наблюдаемых результатов. По уже упомянутым причинам, если лаборатория, выполняющая анализ, не может быть уверена в точности и единообразии выполнения комплекса серийных разведений и титрований, RTU реагенты могут стать вполне обоснованной альтернативой. Это позволит лаборатории достичь стабильных результатов изо дня в день, если единожды была проведена валидация качества специфической окраски на соответствующей FFPE контрольной ткани, обработанной сходным образом (в идеале таким же образом), как и исследуемые ткани.
Вторичные реагенты или реагенты для мечения: протоколы
Одним из первых последствий попыток применить методы, основанные на использовании антител, на FFPE срезах ткани стала попытка разработать высокочувствительные методы мечения. Невысказанная мотивация состояла в том, что если после фиксации в формалине остаются только небольшие количества белка с сохранными антигенными свойствами, то чем больше чувствительность метода детекции, тем больше шансов получить успешную окраску срезов FFPE ткани. Таким
образом, на смену методу РАР, методу АВС, амплификации с тирамидом и методам с использованием полимерных макромолекул (см. главу 10 и Taylor CR et al. [5]), требующих усиления некоторого слабого, но специфичного исходного сигнала, в свою очередь, не подвергая риску специфичность этой исходной реакции, пришел простой косвенный метод, использующий конъюгированные или меченые вторичные антитела. В этом контексте термин «чувствительность» используется в отно-
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 45
Стандартизация иммуногистохимических методов |
Глава 4 |
|
|
|
|
шении способности метода выявить все меньшие количества антигена в срезе ткани или выявлять то же количество антигена при возрастающих рабочих разведениях антитела. Это употребление термина напоминает аналитическую чувствительность в клинической лаборатории, но отличается от более частых применений термина «чувствительность» в диагностической практике, где он относится к способности исследования выявить истинно положительные случаи в популяции пациентов,
укоторых заболевание диагностировано (диагностическая чувствительность).
Вобщих чертах, чем больше чувствительность или усиление сигнала метода детекции, тем более сложным он, вероятно, является и тем больше этапов включает. Следствием этого является то, что создание оптимального протокола и получение воспроизводимых результатов становится сложнее на несколько порядков. Как упоминалось ранее, при определении рабочего разведения концентрированных первичных антител (моноклональных или поликлональных) должна быть выполнена оптимизация в сочетании с оптимизацией всей системы детекции. Одно зависит от другого. Каждая лаборатория должна провести для всех новых реагентов, как первичных, так и вторичных, исследования титрования методом «шахматной доски», которые необходимо впоследствии повторять для каждой новой серии хорошо известных реагентов (см. главу 2 и Taylor CR et al. [5]). Использование RTU реагентов в сочетании с реагентами для детекции и установленными производителем протоколами, избавляет от необходимости проведения сложных процедур титрования. Это, в свою очередь, нивелирует изменения параметров исследования между лабораториями, которые возникают в результате несоответствий в определении оптимальных разведений первичных антител и применения различных реагентов для мечения. Тем не менее, важно отметить, что при использовании RTU реагента с любой системой детекции или протоколом, отличными от утвержденных производителем, должен быть выполнен весь спектр оптимизационных исследований.
Вышеприведенное обсуждение обращает внимание на выбор оптимальной концентрации (или
рабочего разведения) первичных и вторичных реагентов или, вместо этого, использование RTU
реагентов с определенными системами детекции и протоколами. Тем не менее, нельзя забывать о том, что другие аспекты протокола IHC также имеют большое значение для достижения стабильных результатов, включая выбор и валидацию любой процедуры демаскировки антигена, точность объема реагентов, нанесенных на срез, выбор буферов для разведения и их значения рН, оптимизированное время инкубации (при определенной температуре), количество и эффективность циклов промывки, а также концентрация, температура и время инкубации предпочтительного хромогена. В типичном анализе IHC имеется, по крайней мере, 25 отдельных этапов. Все они должны быть оптимизированы и выполняться одинаково от исследования к исследованию, в разные дни и в разных лабораториях. В этом отношении использование автоматизированной системы может в значительной степень улучшить воспроизводимость результатов в пределах лаборатории вне зависимости от того, используются ли концентрированные реагенты и системы детекции, оптимизированные своими силами, или RTU реагенты. Использование RTU реагентов имеет дополнительное преимущество для многих лабораторий: они обеспечивают стандартизацию реагентов, разведений, систем детекции и общего протокола в разных лабораториях.
46 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 4 |
Стандартизация иммуногистохимических методов |
|
|
|
|
Как отмечалось ранее, для окончательной стандартизации IHC требуется, чтобы все лаборатории проводили бы исследование одинаковым образом с одними и теми же реагентами и одина-
ковыми протоколами или, в качестве альтернативы, все применяли бы одинаковые универсальные эталонные материалы (калибровочные стандарты), на основании которых каждая лаборатория будет налаживать свой анализ(ы) IHC и ежесуточно проводить валидацию качества результатов. Ввиду отсутствия этих вариантов, если все лаборатории принимают сходный уровень внутренней согласованности (хоть и с разными реагентами и протоколами), стандартизация в различных лаборато-
риях улучшится. Внутренняя согласованность легче достигается с RTU реагентами, чем при использовании концентрированных реагентов, что связано с естественной изменчивостью оптимизации последних в разных лабораториях. Более того, поскольку некоторые лаборатории применяют одинаковые RTU реагенты, системы детекции и протоколы, улучшится стандартизация в отношении оставшейся основной переменной – приготовления пробы.
Контроли
Для всех анализов IHC необходимо надлежащим образом использовать соответствующие контроли. Этот вопрос кратко обсуждается в главе 19, подробно – у Taylor CR et al [5].
Каждое IHC исследование должно включать как минимум положительный контроль и отрицательный контроль. На практике, положительным контролем обычно является срез ткани, фиксированный и обработанный таким же образом, как и исследуемый срез. Кроме того, положительный контроль должен содержать молекулу-мишень, что доказано при независимом анализе, но чаще наличие молекулы-мишени предполагается на основании данных литературы и предшествующего опыта (например, нормальная ткань молочной железы для ER, нормальная ткань простаты для PSA). Положительные контроли в идеале должны быть выбраны таким образом, чтобы при реакции получался диапазон интенсивности окраски от высокой через промежуточною до слабой. Использование ткани, содержащей очень большие количества антигена, может привести к выбору оптимальных
рабочих разведений, при которых не выявляются более низкие концентрации антигена-мишени, наблюдающиеся в других (патологических) тканях. Термин «отрицательный контроль» обычно охватывает два принципа контроля: «отрицательный контроль реагента», с которым при исследовании параллельного среза ткани, как правило, не используется первичное антитело (в то время как во всем остальном срез обрабатывается таким же образом, как и исследуемый срез), а также «отрицательный контроль ткани или клеток». На практике последний контроль в большинстве случаев проводится путем выявления на срезе ткани неокрашивающихся типов клеток, которые не содержат молекулу-мишень и поэтому не дают положительную реакцию при окраске.
В лабораториях, в которых выбирают использование концентрированных первичных антител, для выявления оптимальных рабочих разведений первичного антитела и реагентов системы детекции следует применять положительный и отрицательный контроли во время всех процедур титрования и валидации качества. Можно использовать методы блокирования отдельной ткани или анализы микромассивов ткани. Для некоторых исследований образцы контрольных тканей могут быть быстро израсходованы при выполнении обширных титрований, необходимых для создания
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 47
Стандартизация иммуногистохимических методов |
Глава 4 |
|
|
|
|
протокола и подтверждения соответствия требованиям для продолжения его использования. При использовании RTU реагентов подход более простой, хотя и, в некоторой степени, прагматичный. Выбранная для положительного контроля ткань (содержащая интересующий антиген и фиксированная таким же образом, как исследуемые в будущем ткани) окрашивается строго в соответствие с протоколом производителя, установленным для RTU, при этом в результате реакции либо наблюдается удовлетворительная специфическая окраска, либо нет. Если специфическая окраска наблюдается, то проводится дальнейшая валидация метода с использованием тканей от дополнительных пациентов и оценка воспроизводимости результатов при повторных исследованиях. Если окраски не наблюдается или определяется неспецифическое окрашивание, то единственно возможным решением проблемы является попытка изменить и оптимизировать процесс демаскировки антигена (или улучшить приготовление пробы). Как отмечено ранее, изменение концентрации RTU реагента или корректировка протокола окрашивания, не совпадающие с рекомендациями производителя, приводит к тому, что процесс валидации качества должен быть выполнен в полном объеме лабораторией, проводящей исследование.
RTU первичные антитела вместе с системой детекции и протоколом исследования обычно устанавливаются производителем, чтобы достичь удовлетворительных результатов при использовании на ассортименте типичных тканей (обычно FFPE ткани), и проверяются на предмет воспроизводимости результатов при разных исследованиях и на разнообразных FFPE тканях, имеющих различные значения содержания антигена-мишени. Целью производителя является обеспечение хороших результатов при использовании RTU реагента с его ассоциированной системой детекции на FFPE тканях, которые могут встретиться во многих различных лабораториях. В идеальном варианте в лаборатории, выполняющей исследование, при использовании RTU реагента с его системой детекции и протоколом на FFPE тканях приемлемые результаты получаются сразу без дополнительных манипуляций. Если при использовании реагента приемлемые результаты не достигаются, может понадобиться переход на использование концентрированных реагентов и проведение специального IHC
исследования с детальным титрованием, анализом методов фиксации ткани, демаскировки антигена и всех аспектов дизайна исследования [3, 5].
Влияние RTU реагентов на другие аспекты дизайна исследования
До сих пор, по существу, внимание было сконцентрировано на реагентах и аналитической фазе суммарного исследования, фазе, где применяются RTU реагенты и где они оказывают наибольшее влияние.
Выбор и валидация качества реагентов, безусловно, являются критическими проблемами, однако самым важным фактором, вызывающим получение различных результатов при IHC исследовании во всем мире, а также в отдельных лабораториях, является преаналитическая фаза [6-10]. Наиболее существенным является практически полное отсутствие постоянства условий фиксации ткани и других аспектов обращения с препаратом. В то время как формалин, безусловно, остается самым широко используемым фиксатором, различаются способы его приготовления (вне зависи-
мости от того, является ли он свежеприготовленным или нет) и время, в течение которого ткани
48 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/