2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdfГлава 15 |
Множественное иммуногистохимические окрашивание |
|
|
методов множественных окрасок значительно упрощает дифференциальную диагностику доброкачественных и злокачественных изменений, что снижает количество сомнительных случаев и потребность в дополнительных биопсиях.
При гибридизации in situ (ISH) обычно используются методы множественных окрасок одного препарата для определения амплификации гена, исходя из интенсивности сигнала или из сравнения исследуемой пробы и референтной. Результат реакции можно оценить как традиционным для флуоресцентной гибридизации в ткани (FISH) способом, так и в световом микроскопе, преобразовав сигнал в хромогенный. Это позволяет оценить не только интенсивность сигнала, но и структуру ткани.
Техническое обеспечение
Прежде, чем приступать к множественному окрашиванию образцов, необходимо обратить внимание на несколько важных моментов:
•так как большинство применяемых первичных антител являются мышиными или кроличьими и визуализируются разными системами (с помощью анти-мышиных или инти-кроличьих антител), необходимо четко их разделять. Это может потребовать детально разработанного протокола;
•бывает трудно провести спектральное разделение цветной метки, особенно при близком расположении гибридизированных участков РНК и зонда, что приводит к смешиванию цветов меток [2]. Цвета, полученные при наложении меток, должны хорошо контрастировать с исходными цветами (например, желтый, получаемый при наложении зеленого и красного). В тех случаях, когда вероятность гибридизации одного из близко расположенных участков мРНК с зондом невелика, важно, чтобы цвет метки более «редкого» зонда был ярче цвета метки более распространенного;
•даже при расположении целевых фрагментов мРНК на достаточном расстоянии друг от друга, бывает сложно откалибровать сигнал более редкой метки на фоне более часто встречающейся. В этом случае можно попробовать изменить концентрацию первичных антител;
•в том случае, если для выявления меток приходится использовать разные увеличения, сложно получить необходимую топографическую информацию.
Предварительная обработка
Множественное окрашивание, как и моноокрашивание, может быть выполнено как на срезах ткани, фиксированной в формалине и залитой в парафин, так и на замороженных срезах, цитологических мазках и на цитоцентрифугированным материале. Применение методов множественных окрасок ограничено тем, что не во всех случаях удается найти протокол обработки срезов, обеспечивающий оптимальное взаимодействие всех реагентов. Часто протоколы подбираются под конкретную окраску в зависимости от выявляемых структур, например, это касается способов демаскировки
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 149
Множественное иммуногистохимические окрашивание |
Глава 15 |
|
|
антигенов. Важно выбрать тот метод обработки, который обеспечит выявление всех исследуемых структур, даже если он не будет оптимальным для некоторых из них.
При выявлении разных структур необходимо выбрать метод, позволяющий сбалансировать сигналы лучшим способом. Сочетать ISH и IHC на одном стекле очень сложно, так как эти методы требуют совершенно разной обработки ткани. Так как некоторые этапы ISH, например, денатурация ДНК, не совместимы с присутствием антител IHC, гибридизацию обычно выполняют первым этапом.
Выбор метода окраски
Чтобы быть уверенным в успехе, необходимо тщательно планировать иммуногистохимическую реакцию. Особенно это важно при проведении множественных реакций. В том случае, если выбор антител не ограничивается ценой и доступностью, и есть возможность использовать и меченные и немеченные первичные антитела, и мышиные и кроличьи, то можно легко подобрать метод окраски. В большинстве же случаев, выбор лимитируется доступностью реагентов [3]. Необходимо следить, чтобы не было перекрестной реакции между реагентами. Предварительное составление схемы проведения реакции (последовательности выполнения операций) или нечто подобное может оказаться полезным при выборе оптимального метода.
В целом, методы окраски можно разделить на несколько групп.
Последовательное окрашивание. В этой методике успех каждой стадии обусловливает успех последующей. Например, после нанесения первых первичных антител на срез наносится визуализирующая система сртептовидин-биотин пероксидаза хрена (HRP) и хромоген, например, DAB. Вторые первичные антитела наносятся только после отмывки остатков хромогена, метятся стрептовидин-биотин щелочной фосфатазой и цветным хромогеном. Главное преимущество последовательной системы окрашивания – более эффективное предотвращение перекрестной реак-
тивности.
Пример последовательного окрашивания представлен на рис. 15.1. Первичные и вторичные антитела первой окраски здесь были отмыты до начала инкубации со следующей меткой. Недостатки этого метода: методика не может применяться для выявления близко расположенных антигенов, часто занимает много времени (длинный протокол окрашивания) и сохраняется риск некорректного двойного окрашивания, обусловленного неполной отмывкой реагентов перед началом следующего этапа окраски.
В результате неэффективной отмывки некоторые высоко аффинные антитела могут остаться
на своих местах, обусловливая ложное окрашивание структур. Результатом промывки также может стать денатурация эпитопов антигенов. Более того, существует риск экранирования первым хромогеном (DAB в приведенном примере) других антигенных структур. Помимо прочего, данная технология не рекомендована для оценки смешанных цветов при выявлении близко расположенных антигенов, потому что не все продукты реакции устойчивы в агрессивном промывочном буфере, рекомендо-
ванном для смывания антител. Чтобы избежать этих проблем и размытия результатов окраски,
150 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 15 |
Множественное иммуногистохимические окрашивание |
|
|
для первой реакции рекомендуют использовать наиболее устойчивые красители, такие как DAB, Fast Red, AEC и X-Gal, после чего можно применять менее стойкие красители.
Одновременное окраши-
вание. При одновременном окрашивании двумя красителями, первичные антитела наносятся одномоментно. Это менее трудоемкий процесс, так как реагенты
можно смешивать. Данная техника Рис. 15.1. Последовательное двойное окрашивание с помощью
может применяться только при наличии подходящих антител.
Можно использовать два метода исследования: прямой, с мечеными первичными антителами,
и непрямой, когда немеченые первичные антитела выделены из сыворотки разных животных, представлены разными изотипами иммуноглобулинов или подклассами IgG [4].
Пример прямого метода – использование первичных антител с флуоресцентной меткой, что непосредственно обеспечивает визуализацию. Это позволяет избежать перекрестных реакций, но применяется редко, так как получаемый сигнал достаточно слабый, как при любых прямых методах. С другой стороны, первичные антитела могут входить в состав конъюгата с ферментами, биотином, гаптенами или флуорохромом, с которым реагируют соответствующие вторичные антитела или стрептовидин. Это менее трудоемкий процесс, чем метод последовательного окрашивания, так как первичные и вторичные антитела можно смешивать на двух этапах реакции. Однако этот метод требует корректного исключения всех перекрестных реакций.
При использовании непрямого метода окрашивания, для экономии времени, можно применять коктейль из первичных антител, так как первичные антитела взаимодействуют с разными вторичными антителами (рис. 15.2). Лучше использовать вторичные антитела, выделенные из сыворотки одного животного: это позволит избежать неожиданных перекрестных взаимодействий. Один из примеров такой системы – новый набор EnVision DuoFLEX от Dako. В состав набора входят первичные мышиные и кроличьи антитела и смесь вторичных козьих антимышмных и антикроличьих антител, меченных HRP и AP соответственно. Для завершения реакции последовательно применяются хромогены. Результатом реакции является двойное окрашивание ткани: первичные мышиные антитела окрашиваются коричневым с помощью DAB, кроличьи – красным с помощью Permanent Red (рис. 15.2). Система была разработана для новой линии RTU коктейлей первичных антител Dako, но может исполь-
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 151
Множественное иммуногистохимические окрашивание |
Глава 15 |
|
|
зоваться с другими смесями антител или отдельными антителами, последовательно наносящимися на срез.
Поэтапное окрашивание. Это метод прямого/непрямого окрашивания, сочетающий использование немеченых антител и конъюгированных антител [3]. Сначала проводится инкубация ткани с немеченым антителом/антителами с соответствующей системой детекции, но без заключительной ферментативной реакции. Ткань обрабатывается нормальной сывороткой животногохозяина, донора первичных антител, перед инкубацией со вторыми, мечеными антителами. Реакция завершается двумя последовательными ферментативными реакциями.
Рис. 15.2. Одновременное двойное окрашивание, выполненное с использованием набора EnVisionTM DuoFLEX смесью моноклональных кроличьих антител анти-AMACR (красный цвет), моноклональных мышиных анти-HMWCK, и моноклональных мышиных анти-CK 5/6 (коричневый/черный цвет). Ткань предстательной железы, фиксация формалином, заливка в парафин.
Поэтапное окрашивание можно применять в тех случаях, когда органичен выбор первичных антител, но реагенты в этом методе смешивать нельзя.
Исследователи часто сталкиваются с тем, что выбор метода окраски диктуется наличием доступных антител, их видовой принадлежностью и характером метки.
Сложности возникают при близком расположении эпитопов антигенов, если для исследования доступны только моноклональные мышиные антитела IgG одного подкласса. В этом случае нельзя применять ни одну из описанных методик.
Раствор Dako Animal Research Kit (ARKTM) содержит реагенты для мечения мышиных антител биотинизированными анти-мышиными Fab фрагментами, его остатки блокируются нормальной мышиной сывороткой. Эта процедура может быть частью многоэтапного окрашивания [5]. Обработка реагентом приводит к образованию нековалентных связей антител с меткой, в результате чего афинность антител не страдает. Кроме того, требуется лишь небольшое количество первичных антител и использование набора не требует проведения длительных процедур очистки.
Другой раствор, Zenon Technology (Invitrogen), разработан для проточной цитометрии. По существу, это та же самая техника, предлагающая меченные наборы для первичных мышиных антител; доступны как ферментные конъюгаты, так и конъюгаты с одним из широко распространенных флуоресцентных красителей.
152 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 15 |
Множественное иммуногистохимические окрашивание |
|
|
Наконец, важно учитывать тот факт, что системы визуализации с двойным распознаванием, например, EnVisionTM + Dual Link System, не имеют видовых различий, в связи с чем их можно применять только в последовательном методе окраски. Следует избегать использования наборов визуализации с нечетко определенным уровнем усиления сигнала, так как нельзя исключить перекрестные реакции.
Выбор метода окраски
Первым делом при выборе способа визуализации метки стоит определиться, будет ли это иммуноферментный метод или флуоресцентный. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. Конечное решение принимается исходя из условий работы и задач исследования.
Окрашивание хромогеном
Примеры пар фермент/хромоген, подходящих для тройного окрашивания:
•Gal/X-Gal/Turquoise, AP/Fast blue, HRP/AEC/Red
•HRP/DAB/Brown, Gal/X-Gal/Turquoise, AP/Fast red
•HRP/DAB/Brown, AP/New Fucsin/Red, HRP/TMB/Green
При выборе комбинаций цветов для множественной окраски с использованием хромогенных красителей, желательно выбирать контрастные по спектру, такие как красный и зеленый, чтобы их было проще различать. При необходимости докрашивания препаратов, при выборе основных красителей стоит учитывать цвет дополнительного красителя. При выявлении близко расположенных антигенов следует так выбирать красители, чтобы легко отличать смесь цветов от чистого окрашивания. Широко применяется двойное окрашивание с использованием хромогенных красителей, но при близком расположении антигенов сложно определить вклад каждого красителя [6]. Подобрать цвета, которые можно однозначно определить для тройного окрашивания, сложнее, особенно при близком расположении антигенов. В этом случае можно применить технику спектральных изображений [2]. Этот метод позволяет сканировать изображение после окрашивания и с помощью специального программного обеспечения выделить чистые цвета из смеси, оценить их распределение и вклад каждого хромогена в итоговое окрашивание.
Выявление редких антигенов
Недостатком иммуноферментных окрасок является узкий динамический диапазон. Процесс преципитации, который является основой метода, идет только при определенном соотношении
концентраций продукта и субстрата. При высоких концентрациях продукт преципитации может ингибировать ход реакции. Более того, в одном препарате сложно выявить редкий антиген и распространенный. Для решения этой проблемы можно катализировать сигнал амплификации – это очень чувствительные процедуры IHC окрашивания (например, CSA от Dako). Этот метод позволяет расши-
рить динамический диапазон редких меток.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 153
Множественное иммуногистохимические окрашивание |
Глава 15 |
|
|
Флуоресцентные красители
Процедура двойного иммунофлуоресцентного окрашивания достаточно хорошо отработана [7]. Некоторые принципы работы с хромогенными красителями используются и при работе с иммунофлуоресцентными. Также необходимо подбирать красители с противоположенными спектральными свойствами. Однако, доступно больше флуоресцентных красителей и линии излучения их спектров ближе, чем хромогенных. Использование множественных флуоресцентных красителей широко применяется в FISH и проточной цитометрии, где сигнал при помощи дихроичных фильтров и фильтров возбуждения/излучения разделяется на отдельные флуоресцентные сигналы. Разделению спектра может способствовать цифровая компенсация перекрытия эмиссионного спектра. Помимо этого, новые флуоресцентные микроскопы, оснащенные системой Laser Scanning Control Microscope, могут разделять сигнал спектра, выделяя до восьми флуорохромных сигналов, при использовании техники множественной окраски, например, в методе эмиссионных обзорных хроматограмм [8].
При близком расположении выявляемых меток, метод иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет их разделить. Это позволяет выявить метки даже при совсем разных их концентрациях, в то время как тонкое смешение цветов хромогенных красителей легко может остаться незаметным при иммуноферметном методе окрашивания.
Иммунофлуоресценция имеет больший динамический диапазон, чем иммуноферметное окрашивание [9]. При использовании этого метода, не применяется ферментативная амплификация сигнала, поэтому динамический диапазон зависит только от чувствительности системы детекции.
С другой стороны, есть некоторые внутренние проблемы с применением иммунофлуоресценции или флуоресцентных методов в целом:
•при непосредственной близости флуорохромов сигнал угасает [10];
•сигнал выцветает при контакте со светом, время флуоресценции ограничено;
•даже в защищенном от света месте флуоресцентный сигнал будет угасать при комнатной температуре;
•результаты, полученные при флуоресцентном окрашивании, отличаются от таковых, полученных при использовании иммуноферментных методов и дополнительного докрашивания тканей;
•для некоторых тканей, фиксированных формалином, характерно фоновое окрашивание, обусловленное аутофлуоресценцией. Это может усложнить интерпретацию результата.
Несмотря на эти недостатки, при иммунофлуоресцентном окрашивании получается чистый, четко ограниченный сигнал, кроме того, метод предпочтителен при работе с близко расположенными метками. Некоторые хромогенные красители, например Fast Red, флуоресцируют – АР-субстрат ярче в флуоресцентном микроскопе, чем в светлом поле (см. главу 11, «FISH анализа на материале, фиксированном в формалине и залитом в парафин»).
154 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 15 |
Множественное иммуногистохимические окрашивание |
|
|
Альтернативой конвертированию флуоресцентного сигнала в хромогенный служат коллоидные, меченные золотом антитела, которые можно использовать в обычной световой микроскопии, усилив сигнал серебром, Green Fluorescent Protein (GFP и его варианты) и Quantum dots (квантовые точки). Последний превосходит традиционные органические красители по нескольким пунктам, таким как яркость (в связи с высоким квантовым выходом) и устойчивость (в связи с меньшей подверженности воздействию солнечных лучей). Они могут быть присоединены к антителам или стрептовидину как альтернативный флуорохром [11, 12]. Однако, размер таких конъюгатов затрудняет проникновение этих неорганических частиц внутрь клеток или органелл.
Автоматизация получения изображения и анализа множественных окрасок
Цифровые системы анализа изображений расширили список используемых красителей, так как можно отказаться от человеческого глаза для выявления и дифференцировки окрашивания. Цифровой сигнал изображения получается на длинах волн возбуждения, соответствующих использованным красителям, и разделяется приемником на отдельные цвета. Таким образом, техника цифрового анализа изображения применима к комбинации флуоресцентных и иммуноферментных красителей.
В детекторе заложены основные цвета восприятия. Детекторы иначе, чем человеческий глаз,
воспринимают и усиливают цвета. В связи с этим, необходимо оптимизировать красители под принимающий фильтр для лучшего взаимодействия с системой детекции.
Система анализа изображений содержит алгоритм, позволяющий компенсировать перекрытие эмиссионного спектра, применимый для проточной цитометрии. Кроме того, с их помощью можно принимать сигнал из определенного диапазона длин волн. Выявление комбинаций нескольких цветов, выбранных независимо от красителя, облегчает интерпретацию результата. Это также дает возмож-
ность определить интенсивность сигнала, что позволяет исключить неспецифическое или фоновое окрашивание конечного изображения.
Другое преимущество цифровой оценки изображения – возможность количественной оценки сигнала. Алгоритм программного обеспечения способен посчитать количество кластеров сигнала, превышающего определенный уровень интенсивности, сосчитать количество клеток разного типа. Например, алгоритм анализа изображения может сосчитать процент положительно окрашенных клеток, объединить результат с процентом положительных клеток по другой мишени и, на основании этого, обозначить диагноз. Более полную информацию о способе получения изображения и его анализе см. главу 18, «Пептидные нуклеиновые кислоты».
Заключение
Многоцветное окрашивание однажды станет рутинным методом, каким сегодня является простое окрашивание тканей. Применение метода будет расширяться, так как он позволяет экономить общее
время процедуры и дает информацию, которую нельзя получить, используя метод одиночного окра-
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 155
Множественное иммуногистохимические окрашивание |
Глава 15 |
|
|
шивания. Реагенты, которые расширяют возможности при выборе технологии окрашивания, такие как меченные первичные антитела и антитела, выделенные из сыворотки разных видов животных, становятся доступнее. В дополнение стоит сказать, что некоторые поставщики предлагают готовые наборы, состоящие из коктейлей антител, применимых для диагностики, и системы визуализации, подобранной для обеспечения правильного сбалансированного окрашивания, которые значительно снижают рабочую нагрузку персонала.
Разработка программного обеспечения для получения и анализа цифрового изображения играет ключевую роль в развитии метода, так как человеческий глаз может воспринять и различить фиксированное количество цветов. Программа анализа изображения никогда полностью не заменит опытного патологоанатома, но алгоритм будет постепенно улучшаться по мере увеличения объема загруженной информации. Однако, программа может быть полезной для выполнения большого объема рутиной работы и, во многих случаях предложить диагноз, последнее же решение будет оставлено за патологоанатомом, которому потребуется лишь принять окончательное решение.
Литература:
1.Molinie V et al. // Modern Pathology. – 2004. – 17. – p. 1180-90.
2.Van der Loos CM // J Histochem Cytochem. – 2008. – 56. – p. 313-28.
3.Van der Loos CM. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. – BIOS Scientifi c Publishers Ltd., 1999.
4.Chaubert P et al. //Modern Pathology. – 1997. – 10.
– p.585-91.
5.Van der Loos CM, Göbel H // J Histochem Cytochem.
– 2000. – 48. – p.1431-7.
6.Merryn VE Macville // Analytical Cellular Pathology. – 2001. – 22. – p. 133-42.
7.Manson DY et al. // J Pathol. – 2000. – 191. – p.452-61.
8.Dickinson ME et al. // Bio Tecchniques. – 2001. – 31.
–p. 1272-8.
9.Landon A et al. // The Journal of Pathology. – 2003. – 200. – p. 577-88(12).
10.Förster Th, Fluoreszenz organischer verbidungen. – Vandenhoeck & Ruprecht, 1951.
11.Wu X et al. // Nat Biotechnol. – 2003. – 21. – p.41-6.
12.The small, small world of quantum dots . – CAP Today.
–2008. – December.
156 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 16 | Оптимизация иммуногистохимических исследований
Gale E. Pace
перевод Л.В. Москвиной
Внедрение иммуногистохимических методов исследования в рутинную практику диагностических лабораторий значительно упростилось, при появлении на рынке стандартизованных реагентов, инструментов и протоколов реакций. Несмотря на это, исследователи, пытающиеся разработать новые протоколы или исследующие новые возможности применяемых тест-систем, должны тщательно подбирать
методы обработки ткани, условия для каждого этапа реакции, которые могли бы обеспечить хороший специфичный сигнал антигена и позволили бы минимизировать неспецифическое окрашивание.
Состав изучаемого образца ткани, с одной стороны, помогает исследователю в разработке нового иммуноморфологического теста, с другой стороны, усложняет эту задачу. Обзорная морфологическая оценка ткани исключительно полезна при оценке специфичности сигнала нового IHC метода. С другой стороны, ткани, как известно, дают выраженное неспецифическое окрашивание и являются источником ферментативных и иных активных веществ, которые могут быть причиной ложного сигнала исследуемых реагентов и усложнять интерпретацию результата реакции. Целью оптимизации метода является увеличение интенсивности и специфичности иммунохимического или ферментного сигнала и подавление шума и артефактов. В этой главе будет рассмотрен состав и использование некоторых базовых иммуногистохимических реагентов, среди которых протеолитические ферменты, применяемые для предварительной обработки ткани, растворители для антител (дилюэнты), растворы, блокирующие неспецифическое взаимодействие и усиливающие реакцию, промывочные растворы и их влияние на результат реакции. Дополнительную информацию по вопросам подготовки ткани, демаскировки антигенов, уменьшения неспецифического реагирования и иных аспектов оптимизации результата иммуногистохимической реакции можно получить в соответствующих разделах данного руководства.
Обработка ткани протеолитическими ферментами
Обработка ткани протеолитическими ферментами часто применяется для разрушения ковалентных связей (метиленовых мостиков), образующихся в результате формалиновой фиксации ткани. Контролируемый протеолиз может улучшить проникновение реагентов в тканевые структуры
ивосстановить конформацию эпитопов антигенов, что позволит первичным антителам связаться с таргетными структурами. Если точки приложения активности протеаз находятся в непосредственной близости от «формалиновых» перекрестных связей, ферментативная обработка может обеспечить ослабление жесткой структуры белков и облегчить взаимодействие между первичными антителами
исоответствующими антигенными детерминантами.
Протеолитические ферменты расщепляют специфические последовательности аминокислот в пептидных цепях обрабатываемых белков. Так как протеазы отличаются по своей расщепляющей способности, они могут оказывать на ткань различные эффекты, в зависимости от типа использованного фиксатора, антигенной структуры и эпитопа, с которым связывается антитело.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 157
Оптимизация иммуногистохимических исследований |
Глава 16 |
|
|
|
|
Так как эффективность протеолиза зависит от множества факторов, оптимальные условия реакции необходимо подбирать эмпирически для каждой ткани, комбинации антител и антигенов. Например, можно предположить, что протеолиз углеводных эпитопов будет неэффективен, так как данные структуры не являются белковыми, однако, обработка гликопротеинов, содержащих углеводные эпитопы, может оказаться полезной, если эпитопы подверглись демаскировке расщеплением и разрушением основной белковой цепи, что позволяет антителу достигнуть целевого эпитопа и связаться с ним. Протеолиз обеспечивает лучшее проникновение реагентов в ткань, что улучшает взаимодействие небелковых антигенов с антителами.
Предварительный эксперимент должен быть направлен на то, чтобы выбрать оптимальный фермент, время инкубации, температуру и концентрацию. Большинство протеолитических ферментов, широко применяемых в IHC, проявляют наивысшую активность при 37°С. Во многих протоколах указывается именно эта температура для достижения оптимального результата в самые короткие сроки. Однако, в некоторых случаях предпочтительно использовать более низкую температуру инкубации. Уменьшая скорость протеолиза, можно увеличить время реакции, улучшить контроль за процессом
–метод, особенно эффективный в ситуациях, требующих медленного протеолиза.
Втабл. 16.1 приведен список некоторых широко применяемых в IHC ферментов и стандартные условия реакции.
Таблица 16.1.
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И СТАНДАРТНЫЕ УСЛОВИЯ РЕАКЦИИ
Фермент |
|
Примерная температура активации |
|
Время инкубации |
Протеиназа К (Proteinase K) |
|
25-37 °C |
|
5 мин. |
|
|
|||
|
|
|
|
|
Трипсин (Trypsin) |
|
37 °C |
|
10 мин. |
|
|
|
|
|
Пепсин (Pepsin) |
|
37 °C |
|
5–20 мин. |
|
|
|
|
|
Протеаза XXIV (Protease XXIV) |
|
37 °C |
|
5–10 мин. |
|
|
|
|
|
Проназа (Pronase) |
|
25-37 °C |
|
30 мин. |
|
|
|
|
|
ПРИМЕЧАНИЕ. Формалин не предохраняет белки ткани от коагуляции. В процессе обработки ткани формалином образуются перекрестные связи между аминокислотами. Фиксация этанол- и ртутьсодержащими растворами основана на коагуляции ткани. Поэтому, за некоторыми исключениями, восстановление структуры антигенов не может быть применена в ткани, фиксированной спиртовыми или ртутными фиксаторами.
158 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/