2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdf
Глава 13
Функция рассеяния точки (Point Spread Function, PSF). Если
небольшая популяция флюоресцентных объектов (диаметром примерно 100 нм) исследуется при высоком разрешении (объектив
х100, 1.4NA, иммерсионное масло
с корректно подобранным коэффициентом преломления), то в горизонтальной плоскости вокруг исследуемых объектов может возникать тонкий ареол (дифрак-
ционный кружок или диск Airy) (рис. 13.16, 13.17). Дифракционный кружок возникает в связи с явле-
ниями дифракции и волновой природой света. Если исследовать образец с помощью оптических срезов, то вокруг каждого сигнала появится серия из концентрических колец. При конструировании трехмерного изображения для каждой точки может быть определена полная функция рассеяния точки. PSF представляет собой радиальное распределение интенсивности свечения и отражает, что происходит с флюоресцентным сигналом после прохождения через оптическую систему. Данная концепция фундаментально важна для понимания процесса деконволюции и происхождения артефактов изображения. Для более подробной информации см. http://www.olympusmicro.com/primer/ digitalimaging/deconvolution/deconintro.html.
Рис. 13.17. Диск Airy представляет собой наиболее яркую окружность по периферии сигнала, возникает вследствие дифракции света при прохождении через узкую круглую апертуру объектива. Изображение предоставлено Applied Precision, Inc. (Issaquah, WA, USA).
Разрешение. Разрешением называется способность показывать раздельно близко расположенные объекты. Разрешение на плоскости и осевое разрешение флюоресцентного микроскопа рассчиты-
ваются как dxy = 0.61 λ /NA и, соответственно dz = 2 (λ n/NA2) , где n – коэффициент преломления.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 139
FISH визуализация |
Глава 13 |
|
|
Например:
Если λ=488 нм и NA=1.4, тогда разрешение на плоскости dxy составит приблизительно 212 нм или 0.212 мкм.
Если λ=488 нм, NA=1.4 и n=1.515, тогда осевое разрешение dz будет равно 754.40 нм или 0.755 мкм.
Частота дискретизации. Оптимальная реконструкция сигнала возможна только если частота дискретизации более 2 (например, 2.3х).
Измеритель мощности лазера
(ваттметр). Используется для измерения мощности лазера, от которой зависит правильная центровка и функционирование оптической системы (рис. 13.18).
Рис. 13.18. Измерение мощности лазера.
Литература:
1.Cremer T, Lichter R, Borden J, Ward D.C., and L. Manuelidis. Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome-specifi c library probes // Hum Genet. – 1988. – 80. – p. 235-246.
2.Kozubek Michal. Confocal and two-photon microscopy: Foundations, applications and advances, FISH imaging // New York: Wiley-Liss. – 2001. – pp. 389-429.
3.Walter J, Joffe B, Bolzer A, Albiez H, Benedetti P.A, Muller S, Speicher M.R, Cremer T, Cremer M, Solovei I. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei // Cytogenet Genome Res. – 2006. – 114.
– p. 327-378.
4.Baerlocher G.M., Vulto I, Gary de Jong & Peter M Lansdorp P.M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (fl ow FISH) // Nature Protocols. – 1. – p. 2365-2376.
5.Zucker R.M., Rigby P, Clements I, Salmon W, Chua P. Reliability of confocal spectral imaging systems: use of multispectral beads // Cytometry. – 2007. – 71A. – p. 174-189.
6.Zucker R.M. Technical note: Whole insects and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: morphology and apoptosis // Cytometry. – 2006. – 69A. – p. 1143-1152.
7.Zucker R.M. and Jeffay S.C. Confocal Laser Scanning Microscopy of Whole Mouse Ovaries: Exellent morphology with apoptosis detection and spectroscopy // Cytometry. – 2006. – 69A. – p. 930-939.
8.Zucker R.M. Confocal Slide Based System: Performance // Cytometry. – 2006. – 69A. – p. 659-676.
9.Zucker R.M. Confocal Microscopy Slide Based System // Cytometry. – 2006. – 69A. – p. 677-690.
10.Zucker R.M. and Lerner J. Wavelength and alignment tests for confocal imaging systems // Microscopy Research and Technique. – 2005. – 68:5. – 307-319.
11.Zucker R.M. Evaluation of confocal Microscopy system performance // (Douglas Taajets Ed.). – Humana Press Chapter 5. – 2005. – pp. 77-135.
12.Hildenbrand G, Rapp A, Sproti U, Wagner C, Cremer C, Hausmann M. Nano-sizing of specifi c gene
140 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 13 |
FISH визуализация |
|
|
domains in intact human cell nuclei by spatially modulated illumination light microscopy // Biophysical Journal. – 2005. – 88. – p. 4312-4318.
13.Swedlow J.R., Hu K, Andrews P.D., Roos D.S., Murray J.M. Measuring tubulin content in toxoplasma gondii: a comparison of laser-scanning confocal and wide-fi eld fl uorescence microscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. – 2002. – 99. – p. 2014-2019.
14.Itoh H, Miyajima Y, Usemura S, Osamura R.Y. Lower HER-2/Chromosome enumeration probe 17 ratio in cytologic HER-2 Fluorescence in Situ Hybridisation for Breast Cancers. Three-dimentional analysis of intranuclear localization of centromere 17 and HER- a signals // Cancer (Cancer Cytopathol). – 114. – p. 134-140.
15.Smallcombe A. Multicolor imaging: the important question of co-localization // Biotechniques. – 2001. – 30. – pp. 1240-1242, 1244-1246.
16.North A.J. Seeng is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition // J. Cell. Biol. – 2006. – 172 (1). – p. 9-18.
17.Chen T, Catryssee P, Gamal E.I., Wandell B. How small should pixel size be? // Proc. SPIE. - 2000. – 3965. – p. 451-459.
18.Konsti J, Lundin J., Jumppanen M, Lundin M, Viitanen A and Isola J. A public-domain image processing tool for automated quantifi cation of fl uorescence in situ hybridization signals // J. Clin. Pathol. – 2008. – 61.
– 278-282.
19.Rauser S, Weis R, Braselmann H, Feith M, Stein H.J., Langer R, Hutzler P, Hausmann M, Lassmann S, Siewert J.R., Hofl er H, Werner M, Walch A. Signifi cance of HER1 low-level copy gain in Barrett’s cancer: implications for fl uorescence in situ hybridization testing in tissues. (Imaging, Diagnosis, Prognosis) // Clin Cancer Res. – 2007. – 5115. – 13-17.
Рекомендуемая литература по микроскопической технике:
1.Stelzer E.H.K. Practical limits to resolution in fl uorescence light microscopy; Imaging neurons: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press. – Heidelberg, Germany. – 2000.
2.Murphy, D.B. Fundamentals of light microscopy and electronic imaging // Wiley-Liss. – 2001.
3.Sluder G. and David E. Wolf (Eds.). Digital microscopy. A second edition of video microscopy // Elsevier-Aca- demic Press. – 2003.
4.Hibbsm A.R. Confocal microscopy for biologists // Kluwer Academic Publishers. – 2004.
5.Goldman, R.D., Spector, D.L. (Eds.). Live cell imaging // A laboratory manual. – 2005.
6.Heath, J.P. Dictionary of microscopy // John Wiley & Sons Ltd. – 2005.
7.Pawley J. (Ed.). Handbook of biological confocal microscopy // Academic Publishers. – 2006.
8.Stephens D. (Ed.). Cell imaging // Scion Publishing Ltd. – 2006.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 141
Глава 14 | Двухцветный CISH и конвертирование FISH в CISH
Ulla Henriksen PhD, Sven Muller PhD и Andreas Schonau MS, EBA
перевод Л.В. Москвиной
Флуорисцентная гибридизация in situ (FISH) – чувствительный и надежный метод, позволяющий оценить генетический статус живых клеток. Метод предложен более 20 лет назад для выявления наличия или отсутствия специфической ДНК последовательности в хромосомах [1]. Метод получил широкое распространение в клинической онкологии. В морфологию FISH вошла как альтернатива или дополнение к IHC исследованиям, была показана ее прогностическая и диагностическая значимость при совместной оценке с экспрессией некоторых маркеров опухолей [2, 3]. Недавно была разработана новая IHC методика, основанная на сигналах хромогена, вместо флуоресцентного сигнала. Техника хромогенной гибридизаии in situ (CISH) имеет ряд преимуществ, упрощающих применение данного метода, что обусловливает рост его популярности:
1.Результаты CISH легко интерпретируются с помощью светового микроскопа, имеющегося в любой лаборатории.
2.CISH не визуализирует ядра, но позволяет разделить инвазивный процесс и рак in situ.
3.Сигнал CISH не выцветает, что делает возможным хранение препаратов в архиве и ретроспективный пересмотр стекол.
4.CISH, как и IHC, (в отличие от FISH) позволяет использовать дополнительные методы окраски ткани, например, гематоксилин, для визуализации структурных компонентов ткани.
Всвязи с тем, что CISH сочетает в себе генетическую информативность FISH с привычным способом визуализации и особенностями интерпретации IHC, он представляет собой достойную альтернативу FISH.
Хромогенная гибридизация in situ (CISH)
Методика проведения CISH, как альтернатива FISH, описана в 2004 году [4]. С этого момента опубликовано множество статей, сравнивающих CISH и FISH. Исследователи сошлись во мнении, что CISH – точный, воспроизводимый метод, имеющий большое сходство с FISH [5-9]. Чувствительность метода не уступает чувствительности FISH при пограничном и низком количестве амплификаций [9]. В основе хромогенной визуализации (колориметрического метода) лежит фермент-зависимая реакция взаимодействия антител с антигеном. Реакция субстрата с ферментом, например, с пероксидазой хрена (HRP), и/или щелочной фосфатазой (AP) вызывает преципитацию хромогена, которую потом можно увидеть в световом микроскопе. Другой подход применения световой микроскопии – гибридизация в тканях с металлографией. При использовании данного метода метка визуализируется с помощью праймера или антитела, осаждающего метал селективно, в зависимости от места связывания. Один из методов металлографии – гибридизация в ткани с осаждением серебром (silverenchanced in situ hybridization, SISH). В основе SISH лежит тот же принцип, что и в CISH, но сигнал метки при SISH имеет черный цвет, обусловленный реакцией преципитации серебра [10, 11]. Несмотря
на преимущества SICH и CISH, оба метода имеют один серьезный недостаток. По традиционной
142 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 14 |
Двухцветный CISH и конвертирование FISH в CISH |
|
|
методике CISH/SISH, на одном препарате можно получить сигнал только одного цвета, в связи с чем детектировать разные сигналы можно только на разных препаратах. DuoCISH™, методика двойного
окрашивания CISH kit, разработанная Dako Denmark A/S, позволяет преодолеть этот барьер, упрощая интерпретацию результатов в случае малого количества генетических копий, повышая наглядность визуализации двух проб одновременно (например, дает возможность дифференцировки истинной амплификации/делеции хромосомной анэуплодии) в одном препарате.
В настоящее время описано несколько таргетных и рефферентных генов, которые могут быть
визуализированы на одном стекле при использовании системы DuoCISH™. Это двухцветная гибри-
дизация в светлом поле (BDISH) для гена HER2 и центромера 17 хромосомы (CEN 17), или гибридизация в ткани с двойным хромогенным выявлением амплификации HER2 онкогена в опухолях молочной железы [12, 13]. Двойной цветной CISH kit (DuoCISH™) преобразует сигнал Texas Red и FITCвыявляемый сигнал в красный и синий хромогенный сигналы (рис. 14.1, 14.2, 14.3). Dako DuoCISH™ использует Fast Red как субстрат щелочной фосфатазы и цианиновый синий в качестве субстрата для пероксидазы хрена. В обоих случаях образуется преципитат, не растворимый ни в воде, ни в органических растворителях, что позволяет монтировать препараты с применением сред на водной или полимерной основе [14]. В результате применения методики DuoCISH™, сигнал получается чистым, точным, а докрашивание гематоксилином позволяет визуализировать морфологические особенности ткани. Сигнал, выходящий из DuoCISH™ красителя, хорошо выявляется уже на малом увеличении (10х, 20х), на большем увеличении можно более четко рассмотреть локализацию метки и посчитать индекс метки (40х, 60х, 100х).
Принципы хромогенной гибридизации в ткани (CISH) и методика преобразования флуоресцентного сигнала (FISH) в хромогенный (CISH)
В состав набора Dako DuoCISH™ Kit входят реагенты, необходимые для преобразования флуоресцентного сигнала (FISH) продукта иммунохимической реакции в хромогенный (CISH) при максимальной интенсивности флуоресцентного сигнала. Вместо фиксации и усиления FISH сигнала, флуоресценция преобразуется в хромогенный сигнал, после чего интерпретируется. В состав набора входят пероксидазный блок, смесь антител, красный и синий хромоген, субстраты и буферы для разведения растворов. С состав смеси антител входят антитела к Texas Red, конъюгированные с АР, преобразующие красный флуоресцентный сигнал в красную хромогенную метку, и антитела к FITC, конъюгированные с HRP, преобразующие зеленый флуоресцентный сигнал в синий хромогенный. На рисунке 14.1 схематично представлены основные этапы CISH и FISH.
На практике реакция FISH должна проводиться непосредственно перед последним этапом дегидратации. Вместо того, чтобы проводить дегидратацию препаратов, стекла опускают в промывочный буфер для CISH, после чего они готовы к дальнейшей обработке. CISH – типичная иммуногистохимическая реакция, включающая стандартные этапы: блокирование эндогенной пероксидазы, обработка клеток/ткани смесью антител для обоих флуоресцентных меток и визуализация результата хромо-
геном. На конечном этапе ядра докрашиваются гематоксилином. Нормальные клетки ткани могут
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 143
Двухцветный CISH и конвертирование FISH в CISH |
Глава 14 |
|
|
|
|
служить внутренним контролем работы антител, так как при правильном проведении процедуры, в ядре должны обнаруживаться обе метки, свидетельствующие о правильном диплоидном наборе хромосом. Результат CISH теста – почти полное, 1:1, отображение FISH сигнала, что свидетельствует о высокой конкордантности методов анализа (рис. 14.2).
FISH
Референсная последовательность ДНК
Референсная последовательность ДНК
Дополнительная важность CISH
Цель применения CISH-реакции после FISH – возможность оценки
препаратов в световом микроскопе, что свою очередь привлекательно тем, что позволяет интерпретировать результаты реакции без применения специальной техники. Более
того, возможно одновременное IHC окрашивание одного среза. В результате простоты оценки и информативной морфологии опухолей (возможность отличить инвазивный рост и рак in situ), оценка CISH препаратов зани-
мает гораздо меньше времени, чем оценка FISH [9]. Кроме того, исследования показали, что внутрилабораторная вариация диагнозов и разница в оценке CISH-препаратов разными исследователями ниже, чем при оценке FISH-стекол. CISH-метод более предпочтителен при работе неопытного патоморфолога [15-17]. Другим преимуществом использования CISH-реакции является то, что флуоресцентный сигнал достаточно быстро выцветает,
из-за «затухания» флуоресцентной метки. Хромогенный сигнал не выцветает, что позволяет пересматривать препарат без проведения дополнительных манипуляций. Наконец, технология CISH
позволяет преобразовывать уже смонтированный FISH-препарат для повторного анализа (рис.14.2).
144 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 14 |
Двухцветный CISH и конвертирование FISH в CISH |
|
|
Применение DuoCISH™
DuoCISH™ можно использовать для препаратов, гибридизированных с праймером, меченным Texas Red и FITC. Не смотря на то, что набор не утвержден для выявления определенных нарушений, его можно использовать для визуализации генетических повреждений, в том числе амплификаций генов, делеций и транслокаций на ткани, фиксированной в формалине, и залитой в парафин. Процедура окраски – простая IHC реакция, которая может быть проведена вручную или автоматически (например, в автостейнере Dako Avtostainer или AutostainerLink platforms). Визуализация с помощью
DuoCISH™ позволяет оценивать сигнал даже на малом увеличении (рис. 14.3).
Рис. 14.3. Примеры FFPE карциномы молочной железы с амплификацией генов (справа) и без нее (слева), окрашено
Dako DuoCISH™, об. 20х (вверху), 40х (в середине), 60х (снизу).
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 145
Двухцветный CISH и конвертирование FISH в CISH |
Глава 14 |
|
|
Заключение и перспективы CISH
Множество исследований посвящено сравнению CISH и FISH, большинство из них связано с выявлением повреждений гена HER2. В большинстве работ сопоставимость методов составляет 90% и CISH признается альтернативным FISH методом [6, 18, 19]. Разница в интерпретации CISH и FISH препаратов первоначально была отмечена в случаях пограничного или низкого числа амплификаций, специфических генетических нарушений, в том числе полисомии и анэусомии или при гетерогенных изменениях. Поэтому большинство компаний, поддерживающих CISH, были нацелены на использование одноцветного CISH, который обеспечивал выявление таргетного гена и исследование двух препаратов, окрашенных параллельно. Вместе с тем, применение двойного CISH окрашивания позволяет выявлять два разных сигнала в одном препарате. Основываясь на этих наблюдениях, можно сказать, что будущее CISH технологий скорее за двойным окрашиванием, чем за монохромным, так как в первом случае меньше вероятность ошибочной интерпретации. Несмотря на преимущества CISH, причиной опасений было неэффективное преобразование сигнала и высокий уровень шума при добавлении дополнительного уровня визуализации метки. Однако, исследования Dako DuoCISH™ показали отсутствие неспецифического связывания цветной метки с интактными структурами ткани и показали, что CISH не выявляет сигнал, которого не было при FISH. Это доказывает высокую степень соответствия FISH и CISH.
Результаты ряда исследований показали, что CISH может применяться наравне с FISH и дополнять IHC методы определения HER2 статуса рака молочной железы. Исследование HER2 проводится в рамках руководства ASCO-CAP [20], сегодняшняя тенденция заключается в использовании FISH HER2 вместо IHC. Оценка HER2 CISH с позиций прогностической и диагностической значимости метода позволяет включить его в ряд стандартов для выявления HER2.
Литература:
1.Pinkel D, Straume T, Gray JW. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fl uorescence hybridization // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1986. – 83(9). – p. 2934-8.
2.Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV et al. retrospective analysis of
topoisomerase IIa amplifi cations and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fl uorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fl uorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group
// J Clin Oncol . – 2005. – 20. – 23(30). –p.7483-90.
3.Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplifi cation of the HER-2/ neu oncogene // Science. – 1987. – 235(4785). – p. 177-82.
4.Tanner M, Gancberg D, Di Leo A, Larsimont D, Rouas G, Piccart MJ, Isola J. Chromogenic in situ hybridiza-
146 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
tion: a practical alternative for fl uorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplifi - cation in archival breast cancer sample // Am J Pathol.
–2000. – 157(5). – p. 1467-72.
5.Di Palma S, Collins N, Faulkes C, Ping B, Ferns G, Haagsma B, Layer G, Kissin MW, Cook MG. Chromogenic in situ hybridisation (CISH) should be an accepted method in the routine diagnostic evaluation of HER2 status in breast cancer // J Clin Pathol. – 2007.
–60(9). – p. 1067-8.
6.Gong Y, Gilcrease M, Sneige N. Reliability of chromogenic in situ hybridization for detecting HER-2 gene status in breast cancer: comparison with fluorescence in situ hybridization and assessment of interobserver reproducibility // Mod Pathol. – 2005. – 18(8). – p. 1015-21.
7.Hauser-Kronberger C, Dandachi N. Comparison of chromogenic in situ hybridization with other methodologies for HER2 status assessment in breast cancer // J Mol Histol. – 2004. – 35(6). – p. 647-53.
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 14 |
Двухцветный CISH и конвертирование FISH в CISH |
|
|
8.Sáez A, Andreu FJ, Seguí MA, Baré ML, Fernández S, Dinarés C, Rey M. HER-2 gene amplifi cation by chromogenic in situ hybridisation (CISH) compared with fl uorescence in situ hybridisation (FISH) in breast can- cer-A study of two hundred cases. // Breast. – 2006.
–15(4). – p. 519-27.
9.Bhargava R, Lal P, Chen B. Chromogenic in situ hybridization for the detection of HER-2/neu gene amplif i cation in breast cancer with an emphasis on tumors with borderline and low-level amplifi cation: does it measure up to fl uorescence in situ hybridization? // Am J Clin Pathol. – 2005. – 123(2). – p. 237-43.
10.Powell RD, Pettay JD, Powell WC, Roche PC, Grogan TM, Hainfeld JF et al. // Hum Pathol. – 2007. – 38(8).
–p. 1145-59.
11.Dietel M, Ellis IO, Höfl er H, Kreipe H, Moch H, Dankof A at al. Comparison of automated silver enhanced in situ hybridisation (SISH) and fl uorescence ISH (FISH) for the validation of HER2 gene status in breast carcinoma according to the guidelines of the American Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologists // Virchows Arch. . – 2007. – 451(1).
–p. 19-25.
12.Nitta H, Hauss-Wegrzyniak B, Lehrkamp M, Murillo AE, Gaire F, Farrell M at al. Development of automated brightfi eld double in situ hybridization (BDISH) application for HER2 gene and chromosome 17 centromere (CEN 17) for breast carcinomas and an assay performance comparison to manual dual color HER2 fl uorescence in situ hybridization (FISH) // Diagn Pathol.
–2008. – 22. – p. 3-41.
13.Laakso M, Tanner M, Isola J. Dual-colour chromogenic in situ hybridization for testing of HER-2 oncogene amplifi cation in archival breast tumours. // J Pathol. – 2006. – 210(1). – p. 3-9.
14.Petersen KH. Novel horseradish peroxidase substrates for use in immunohistochemistry // J Immunol Methods. – 2009. – 1. – 340(1). – p.86-9.
15.van de Vijver M, Bilous M, Hanna W, Hofmann M, Kristel P, Penault-Llorca F, et al. Chromogenic in situ hybridisation for the assessment of HER2 status in breast cancer: an international validation ring study. // Breast Cancer Res. – 2007. –9(5). – p. 68.
16.Bilous M, Morey A, Armes J, Cummings M, Francis G. Chromogenic in situ hybridisation testing for HER2 gene amplif i cation in breast cancer produces highly reproducible results concordant with fl uorescence in situ hybridisation and immunohistochemistry // Pathology. – 2006. – 38(2). –p. 120-4.
17.Di Palma S, Collins N, Bilous M, Sapino A, Mottolese M, Kapranos N et al. A quality assurance exercise to evaluate the accuracy and reproducibility of chromogenic in situ hybridisation for HER2 analysis in breast cancer // J Clin Pathol. – 2008. – 61(6). – p. 757-60.
18.Isola J, Tanner M, Forsyth A, Cooke TG, Watters AD, Bartlett JM. Interlaboratory comparison of HER-2 oncogene amplif i cation as detected by chromogenic and fl uorescence in situ hybridization. // Clin Cancer Res. – 2004. – 15. –10(14). – p. 4793-8.
19.Arnould L, Denoux Y, MacGrogan G, Penault-Llorca F, Fiche M, Treilleux I et al. Agreement between chromogenic in situ hybridisation (CISH) and FISH in the determination of HER2 status in breast cancer. // Br J Cancer. – 2003. – 19. –88(10). – p. 1587-91.
20.Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred DC, Cote RJ et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. // Arch Pathol Lab Med. – 2007. 131(1). – p. 18-43.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 147
Глава 15 | Множественное иммуногистохимические окрашивание
Nanna K. Christensen PhD и Lars Winther PhD
перевод Л.В. Москвиной
Иммуногистохимические реакции применяются как с исследовательской, так и с диагностической целью. В ряде случаев необходима оценка взаимного расположения исследуемых компонентов ткани, что возможно только при одновременной визуализации их в одном препарате. В этой главе описаны преимущества применения множественных IHC окрасок, особое внимание уделяется способам оценки качества окраски. Кроме этого, обсуждаются наиболее подходящие протоколы окрасок и визуализационные системы.
Преимущества множественного окрашивания
Множественное окрашивание может быть определено, как селективное выявление двух и более структур в одном препарате, в связи с чем повышается информативность препарата и уменьшается время, затрачиваемое на сравнение препаратов, окрашенных различными методами, или на исследование серийных срезов. Кроме этого, технология множественного окрашивания позволяет оценить взаимное расположение исследуемых компонентов и определить, находятся ли они в разных или в одной клетке или даже в одном клеточном компартменте. В дополнение стоит сказать, что техника множественного окрашивания позволяет комбинировать гибридизацию в ткани (FISH) и IHC, характеризуя ткань на белковом и молекулярном уровне (ДНК/мРНК). Можно также получать информацию о пространственных взаимоотношениях тканей разных типов. Учитывая ужесточение требований к ивазивным диагностическим процедурам, техника множественного окрашивания имеет дополнительные преимущества, позволяя экономить время и реагенты, а также эффективно использовать ограниченный объем биопсийного материала.
Примеры множественных окрасок
Диагностика простатической интраэпителиальной неоплазии (PIN) – лишь один пример эффективности клинического применения множественных окрасок. Тонкоигольная биопсия предстательной железы – рекомендованный метод ранней диагностики рака предстательной железы – в ряде случаев может быть неоднозначно оценена из-за того, что в биоптате может содержаться мало злокачественных желез или в ткани присутствуют доброкачественные процессы (гиперплазия), похожие на опухоль [1]. Так как доброкачественные изменения предстательной железы характеризуются сохранением базального слоя клеток, а злокачественные – его нарушением, клетки базального слоя можно использовать в дифференциальной диагностике рака предстательной железы и гиперплазии. Клетки базального слоя выявляются при помощи IHC реакции с высокомолекулярными цитокератинами, цитокератином 5/6 или белком р63. Кроме этого, рак предстательной железы характеризуется высоким уровнем экспрессии гена p504s, альфа-метил-СоА-рацемазы, в то время как доброкачественная гиперплазия – отсутствием или низким уровнем экспрессии гена, в связи с чем белок используется в качестве маркера рака (рис. 15.1). При использовании метода одиночной окраски
серийных срезов, подозрительный участок ткани может срезаться, особенно если размеры его невелики, в результате чего злокачественное новообразование будет не диагностировано. Применение
148 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/