2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdfГлава 8 |
Демаскировка антигенов |
|
|
|
|
Необходимые материалы:
PTLink (код РТ100/РТ101) и PTLink промывочная станция (код РТ 109).
Силанизированные стекла (код S3003) или стекла, покрытые другим подходящим адгезивом.
Раствор для демаскировки антигена, рН 9.0, х10 концентрированный, (3-в-1) (код S2375)*.
Промывочный буфер Dako (х10) (код S3006).
Протокол
Наденьте перчатки для работы с любым из реагентов, используемых в PTLink. Рекомендуется приготовить рабочий раствор 3-в-1 и промывочного буфера с использованием PTLink.
1.Приготовить рабочий раствор выбранного реагента для демаскировки антигена согласно инструкциям.
2.Наполнить емкости PTLink достаточным количеством (1,5 л) рабочего раствора так, чтобы он покрывал стекла.
3.Установить температуру предварительного нагрева 65°С.
4.Поместить стекла с парафиновыми срезами в предварительно нагретый раствор для демаскировки антигена (рабочий раствор) в емкости PTLink и инкубировать 20-40 минут при температуре 97°С. Оптимальное время инкубации должно быть определено пользователем.
5.Оставить срезы в PTLink для охлаждения до температуры 65°С.
6.Извлечь каждую кассету со стеклами из PTLink и немедленно перенесите в емкость (PTLink
промывочная станция), содержащую разведенный промывочный буфер Dako комнатной темпе-
ратуры (10х).
7.Оставить стекла в промывочном буфере на 1-5 минут.
8.Поместить в автостейнер и продолжать процедуру окрашивания. Следить за тем, чтобы стекла не высыхали во время обработки и дальнейшего окрашивания.
9.После окрашивания провести дегидратацию, просветление и накрыть покровными стеклами.
* При использовании PTLink 3-в-1 процедуры разведенный раствор для депарафинизации/демаскировки можно использовать 3 раза в течение 5 дневного периода, если хранить при комнатной температуре.
Благодарности
Мы благодарим за участие в создании этого раздела: Thomas Boenisch, Ole Feldballe Rasmussen, Kenlyn Crosby,
Gitte Nielsen, Katherine Ellison, Tony Knoll. Marianne Knudsen, Stefan Cuoni Teilmann, Helle Grahn Wendelboe, Majken
Nielsen and Helene Metz (редакторская правка).
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 89
Демаскировка антигенов |
Глава 8 |
|
|
Литература:
1.Boenisch T. Heat-induced antigen retrieval: What are we retrieving? // J Histochem and Cytochem. – 2006.
– 54. – p. 961-964.
2.Boenisch T. Diluent buffer ions and pH: Their infl u- ence on the performance of monoclonal antibodies in immunohistochemistry // Appl Immunohistochem Mol Morphology. – 1999. – 7. – p. 300-306.
3.Shi S-R, Key ME, Kalra KL. Antigen retrieval in for- malin-fi xed, paraffin-embedded tissues: An enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections // J Histochem Cytochem. – 1991. – 39. – p. 741-748.
4.Shi S-R, Cote RJ, Chaiwun B, Young LL, Shi Y, Hawes D, et al. Standartization of immunohistochemistry based on antigen retrieval technique for routine forma- lin-fi xed tissue sections // Appl Immunohistochem Mol Morphology. – 1998. – 6. – p. 89-96.
5.Boenisch T. Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fi xation // Appl Immunohistochem Mol Morphology. – 2005. – 13. – p. 283286.
6.Taylor CR, Shi SR, Chen C, Young L, Yang C: Comparative study of antigen retrieval heating methods: Microwave, microwave and pressure cooker, autoclave, and steamer // Biotech Histochem. – 1996. – 71. – p. 263-270.
7.Pileri SA, Roncodor G, Ceccarelli, C, Piccioli M, Briskomatis A, Sabattini E, et al: Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: A comparison of different methods // J Pathol. – 1997. – 183. –p. 16-23.
8.Tacha D and Teixera M. History and overview of antigen retrieval: Methodologies and critical aspects // J Histotechnol. – 2002. – 25. – p. 237-242.
9.Larsson LI. Tissue preparation methods for light microscopic immunohistochemistry // Appl Immunohistochem Mol Morphology. – 1993. – 1. – p. 2-16.
10.Shi S-R, Imam SA, Young L, Cote RJ, Taylor CR. Antigen retrieval under the infl uence of pH using monoclonal antibodies // J Histochem Cytochem. – 1995. – 43.
– p. 193-201.
11.Bankfalvi A, Navabi H, Bier B, Bocker W, Jasani B, Schmid KW. Wet autoclave pretreatment for antigen retrieval in diagnostic immunohistochemistry // J Pathol. – 1994. – 174. – p. 223-228.
12.Shin RW, Iwaki T, Kitamoto T, Tateishi J. Hydrated Autoclave pretreatment enhances tau immunoreactivity in formalin-fi xed normal and Alzheimer’s disease brain tissues // Lab Invest. – 1991. – 64. – p. 693-702.
13.Shin RW, Iwaki T, Kitamoto T, Sato Y, Tateishi J. Massive accumulation of modifi ed tau and severe depletion of normal tau characteriza the cerebral cortex and white matter of Alzheimer’s disease // Am J Pathol. – 1992. – 140. – 937-945.
90 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 9 | Иммуногистохимические методы окраски
Marc Key PhD
перевод Н.В. Даниловой
Иммуногистохимия является ценным исследовательским методом для получения информации, дополняющей стандартные морфологические окраски. Использование иммуногистохимии для изучения клеточных маркеров, определяющих специфический фенотип, предоставляет важную диагностическую и прогностическую информацию о статусе болезни и ее биологии. Использование антител в молекулярных исследованиях патологии ткани потребовало адаптации и уточнения иммуногистохимических методик, в частности при использовании фиксированных формалином тканей. В отличие от жидкостных (solution-based) иммунологических методик, которые позволяют выявить белки, присутствующие в ткани высоких концентрациях, на фиксированной ткани сохранность антигена вариабельна и непредсказуема. Таким образом, история иммуногистохимии представляет собой попытки повысить чувствительность антител к малым количествам антигенов с целью интегрировать тканевой анализ с результатами молекулярно-биологических тестов.
Вводные замечания
Поскольку наиболее качественная морфология обеспечивается при изготовлении срезов с фиксированных формалином и залитых в парафин тканей, то это стало камнем преткновения для большинства клинических и других исследований. В 1968 году была предложена пероксидазная методика, которая стала не только первым методом окраски антителами парафиновых срезов, но и превзошла некоторые ограничения более ранних флуоресцентных методик [1]. Эти передовые исследования с использованием ферментной метки вместо флуоресцентного красителя открыли новую эру современных иммуногистохимических методов.
Успешное применение иммуногистохимических методик на парафиновых срезах биопс ийного мате - риала стимулировало быстрый прогресс в этой новой развивающейся области и по цепочке привело к внедрению в практику метода иммунопероксидазных мостиков [2] и пероксидазноантипероксидазного
(РАР) метода (рис.9.1) [3].
Комплекс пероксидазы 
с анти-пероксидазой
Вторичное антитело
Первичное антитело 
Антиген в ткани
Рис. 9.1. Пероксидазно-антипероксидазный (РАР) метод.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 91
Иммуногистохимические методы окраски |
Глава 9 |
|
|
Авидин-биотиновая методика
В 1981 году с распространением авидин-биотиновых методов появилось целое поколение иммуногистохимических методов, широко распространенных и сегодня [4]. Все авидин-биотиновые методы основаны на сильной аффинности авидина или стрептавидина к биотину (витамин Н).
Стрептавидин (получаемый из Streptomyces avidinii) и авидин (из куриного яйца) связываются с биотином четырьмя связями. Молекула биотина легко конъюгирует с антителами и ферментами. В авидин-биотиновом методе (рис. 9.2) вторичные антитела конъюгируют с биотином и играют роль мостика между связанными с тканью первичными антителами и авидин-биотин-пероксидазным комплексом [5].
В похожей методике, меченный стрептавидинбиотин (LSAB), также используются биотинированные вторичные антитела, которые связывают первичные антитела с конъюгатом стрептавидинпероксидаза (рис. 9.3) [6]. В обоих методах одно п е р в и ч н о е а нт и те л о последовательно (через несколько этапов) связывается с многочисленными пероксидазными моле-
кулами, что обеспечивает увеличение чувствительности по сравнению с прямым пероксидазным методом благодаря большому сродству фермента к антителу.
Поскольку авидин представляет собой гликопротеин, и его изоэлектрическая точка находится в районе рН 10, он имеет склонность к неспеци-
фическому связыванию с
Комплекс авидин-биотин
Реагент готовится за 30 минут до использования
Вторичное
антитело
коньюгированное с биотином
Первичное
антитело
Антиген в ткани
Рис. 9.2. Авидин-биотиновая непрямая (ABC) методика.
Комплекс 
стрептавидин-фермент
Вторичное мышиное/кроличье антитело, 
коньюгированное с биотином
Первичное
антитело
Антиген в ткани
Рис. 9.3. Методика с меченным стрептавидин-биотином (LSAB).
92 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 9 |
Иммуногистохимические методы окраски |
|
|
лектинами и лектиноподобными веществами, а также с отрицательно заряженными компоненами тканей при физиологических рН. С другой стороны стрептавидин имеет более нейтральную изоэлектрическую точку и небольшое количество углеводных групп. Эти различия снижают неспецифической реакции в ткани.
Полимерные системы в иммуногистохимии
Несмотря на то, что стрептавидин-биотиновые методы все еще широко применяются в повседневной практике, они имеют определенные ограничения при определенных условиях. Присутствие эндогенного биотина в ткани может привести к появ- 
лению неспецифического 
окрашивания при опреде- 
ленных обстоятельствах.
Формалиновая фиксация и заливка в парафин значи-
тельно сокращают количество эндогенного биотина, однако остаточная актив-
ность может наблюдаться в отдельных тканях, таких как печень или почка. Более того, с введением в практику метода температурной демаскировки антигенов, восстановление биотина стало одним из
нежелательных побочных эффектов. Существуют
методы частичной инактивации эндогенного биотина, однако это добавляет еще один этап в и без того сложную процедуру иммуногистохимической окраски. Эти недостатки усугубляются при использовании свежезамороженных срезов, в которых уровень эндогенного биотина обычно выше, чем в фиксированных.
Ввиду описанных недостатков стрептавидин-биотиновых методик, сейчас активно развиваются и завоевывают популярность иммуногистохимические методы с применением полимерных систем детекции (рис. 9.4.) [5]. Данные методики используют уникальную технологию, в которой на полимерную основу «насаживаются» многочисленные молекулы антител и ферментов. В системе ЕРОS (Enhanced
Polymer One Step)* с одной декстрановой основой конъюгировано примерно 70 молекул фермента и 10 молекул первичного антитела. Это позволяет сократить всю процедуру иммуногистохимического окрашивания (от первичного антитела до фермента) до одного шага [6]. С другой стороны, недостатком этого метода является необходимость использования только тех первичных антител, которые предоставляет производитель набора и невозможность использования других антител, имеющихся у пользователя.
*Эксклюзивная методика компании Dako
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 93
Иммуногистохимические методы окраски |
Глава 9 |
|
|
Для решения этой проблемы был разработан новый тип декстранового полимера, EnVisionTM*. Эта система содержит полимерную молекулу, к которой присоединены молекулы фермента и, в отличие от EPOS, содержащего первичные антитела, EnVisionТМ содержит вторичные антитела, специфичные к мышиным или кроличьим иммуноглобулинам. Этот универсальный реагент может быть использован для обнаружения любого первичного антитела, связанного с тканью, мышиного или кроличьего происхождения. Эффективное использование данного метода дало начало новому семейству полимерных методов. Чувствительность этих методов в сравнении с LSAB и АВС была сопоставима или даже в большинстве случаев выше [7]. В связи с разработкой нового метода EnVisionТМ FLEX+, чувствительность стала еще выше. Однако при высоком молекулярном весе полимерных конъюгатов, в небольшом количестве случаев ограничивается доступность некоторых эпитопов из-за пространственных затруднений.
Метод амплификации с тирамидом
Данная методика основана на способности фенольных соединений окисляться в высокореактивные и нестабильные интермедиаты [8]. При окислении биотинил тирамида происходит димеризация с богатыми электронами ароматическими соединениями, подобными тем, которые обнаруживаются в молекулах белков [9]. Эта реакция может быть использована в иммуногистохимии для синтеза высокоактивных интермедиатов биотинил-тирамида, которые быстро связываются с белковыми молекулами при непосредственном участии пероксидазных ферментов. Тирамид, предварительно связанный с биотином, переходит в нерастворимую форму и оседает в ткани около фермента.
В стандартных иммуногистохимических методиках пероксидазная метка сперва соединяется с первичным антителом любым из стандартных иммуногистохимических методов, например ABC или LSAB. Биотинил-тирамид и перекись водорода используются в качестве субстрата для генерации множества биотиновых (биотинил-тирамид) сигналов.
Затем добавляют комплекс стрептавидин-пероксидаза, который присоединяется к тирамиду, и далее конвертируется в хромогенный сигнал с помощью диаминобензидина или другого реагента [10].
Циклическая амплификация с тирамидом
Последовательность стрептавидин-пероксидаза и тирамид-биотин можно ампфлицировать. На практике однако цикл нельзя повторить более 2-3 раз, поскольку возрастает и фоновое окрашивание. Доступны коммерческие наборы для амплификации с тирамидом, такие как Tyramide Signal Amplifi cation (TSA, DuPont NEN Life Sciences, Boston, MA) и Catalyzed Signal Amplifi cation (CSA)*.
Метод амплификации с тирамид-флюоресцином
В соответствии с сегодняшними тенденциями в иммуногистохимии развивать методы, альтернативные стрептавидин-биотиновому, был предложен метод амплификации с тирамидфлюоресцином (FT-CSA)*. В этой методике пероксидаза связывается с первичными антите-
* Эксклюзивная методика компании Dako.
94 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 9 |
Иммуногистохимические методы окраски |
|
|
лами с помощью вторичных антител против Ig мыши, с которыми и конъюгирован фермент. Пероксидаза катализирует конверсию и отложение тирамид-флюоресцина на срезе. Реакция может быть прервана на этом этапе и анализирована с помощью флюоресцентного микроскопа, или же сигнал может быть «перекодирован» в световой с помощью последовательной ампфликации антител к флюоресцину, конъюгированных с пероксидазой хрена и последующей обработкой диаминобензидином.
По сравнению со стандартными IHC методами, амплификация с тирамид-флюоресцином увеличивает чувствительность в 50 и более раз [11]. Но, как при любом методе с использованием амплификации, вместе со специфическим сигналом уровень фона возрастает. Поэтому чрезвычайно важно использовать соответствующие положительный и отрицательный контроль и интерпретировать любое положительное окрашивание в контексте негативного контроля.
Амплификация по методу «катящегося кольца»
Амплификация по методу катящегося кольца (Rolling Circle Amplifi cation, RCA) представляет собой систему амплификации сигнала, которая генерирует локальный сигнал с помощью продления и амплификации олигонуклеотидного конца. Несмотря на то, что изначально метод разработан для обнаружения нуклеиновых кислот, он может применяться и в иммуногистохимии. RCA-амплификация успешно применяется для обнаружения разнообразных внутри- и внеклеточных антигенов [12]. В методе используется короткая олигонуклеотидная последовательность, связанная с молекулой первичного или вторичного антитела. После связывания с тканью, происходит гибридизация олигонуклеотида с добавленной в растворе нуклеиновой кислотой, имеющей комплементарную нуклеотиду последовательность. Олигонуклеотид играет роль праймера и линейно удлиняется, благодаря использованию ДНК-полимеразы и повторяющегося цикла. Удлиненная ДНК затем гибридизуется с меченными олигонуклеотидными пробами. Такой меткой может быть, например, биотин, который в дальнейшем можно визуализировать одним из известных авидин-биотиновых методов. Специфичность метода RCA исходит из специфического взаимодействия антигена и антитела, а его чувствительность из синтеза нуклеиновых кислот. RCA усиливает сигнал в 105 раз [13].
Заключение
Поскольку методы иммуногистохимии продолжают эволюционировать, область их применения в диагностических и исследовательских целях расширяется. Многочисленные варианты с использованием амплификации настолько улучшили метод, что многие антигены, которые считались безнадежно потерянными при фиксации или заливке в парафин, можно теперь без труда обнару-
жить. Однако, поскольку чувствительность иммуногистохимии продолжает возрастать, возможно, есть необходимость пересмотреть существующие критерии оценки реакции и клиническую интерпретацию.
Новые методы с использованием амплификации продолжают развиваться, каждый со своими
преимущетсвами и недостатками, и предоставляют исследователям и клиницистам широкий арсенал
средств, что сильно влияет на методику иммуногистохимии. Вместе с развитием технологий, появля-
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 95
Иммуногистохимические методы окраски |
Глава 9 |
|
|
ются новые панели маркеров, дающие возможности для новых открытий. По мере добавления новых маркеров в эту панель, увеличивается и наше знание о биологии и патогенезе болезни, однако полное понимание всех патологических процессов по-прежнему остается далеким будущим.
Литература:
1.Nakene PK. Simultaneous localization of multiple tissue antigens using the peroxidase labeled antibody method: A study of pituitary glands of the rat // J Histochem Cytochem. – 1968. – 16. – p. 557-560.
2.Mason TE, Phifer RF, Splcer SS. An Immunoglobulinenzyme bridge method for localizing tissue antigens // J Histochem Cytochem. – 1969. – 17. – p. 563-569.
3.Sternberger LA, Hardy PH Jr., Cuculis JJ, Meyer HG. The unlabeled antibody-enzyme method of Immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase- antihorse-radish peroxidase) and its use in identifi cation of spirochetes // J Histochem Cytochem. – 1970.
– 18. – p. 315.
4.Hsu SM, Raine L, and Fanger H. Use of avidin-biotin peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures // J Histochem Cytochem. – 1981. – 29. – 577-580.
5.Heras A, Roach CM, Key ME. Enhanced polymer detection system for immunohistochemistry // Lab Invest. – 1995. – 72. – p. 165 (Abstract).
6.Chilosi M, Lestani M, Pedron S, Montagna L, Benedetti A, Pizzolo G, Menestrine F. A rapid immunostaining method for frozen sections // Biotech Histochem.
– 1994. – 69. – p. 235.
7.Sabattini E, Bisgaard K, Ascani S, Poggl S, Piccioli M, Ceccarelli C. The EnVisionTM system: a new immunohistochemical method for diagnostics and research. Critical comparison with the APAAP, ChemMateTM,
CSA, LABC and SABC techniques // J Clin Pathol. – 1998. – 51. – 506-511.
8.Gross AJ, Sizer IW. The oxidation of tyramine, tyrosine and related compounds by peroxidase // J Biol Chem.
– 1959. – 234. – 1614-1622.
9.Bobrow MN, Harris TD, Shaughnessy KJ, Litt GJ. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplifi cation. Application to immunoassays // J Immunol Methods. – 1989. – 125. – p. 279-285.
10.Adams JC. Biotin amplifi cation of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains // J Histochem Cytochem. – 1992. – 40. – p. 1457-63.
11.Merz H, Malislus R, Mann-Weller S, Zhjow R, Hartmann W, Orscheschek K, Moubayed P, Feller AC.
Methods in laboratory investigation immunomax. A maximized immunohistochemical method for the retrieval and enhancement of hidden antigens // Lab Invest. – 1995. – 73. – p. 149-156.
12.Gusev Y, Sparkowski J, Raghunathan J, Ferguson H, Montano J, Bogdan N, Schweitzer B, Wiltshire S, Kingsmore SF, Maltzman W, Weeler V. Rolling circle amplifi cation. A new approach to increase sensitivity for immunohistochemistry and fl ow cytometry // Am J Pathol. – 1992. – 159. – p. 63-75.
13.Wiltshire S, O’Malley S, Lambert J, Kukanshis K, Edgar D, Kikngsmore S, Schweitzer B. Detection of multiple allergen-specifi c IgE on microarrays by immunoassay with rolling circle amplifi cation // Clin Chem.
– 2000. – 46. – p. 1990-1993.
96 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 10 | Иммунофлюоресценция
J. Paul Robinson PhD, Jennifer Sturgis BS, George L. Kumar PhD
перевод Н.В. Даниловой
Иммунофлюоресценция (IF) – обычная лабораторная методика, применяемая во многих отраслях биологии и медицины. Метод, основан на работах АН Coons и МН Kaplan [1,2] широко используется в научной и клинической практике. Области применения включают в себя оценку параметров клеток в суспензии, культур клеток, тканей, сфер и микроматриц для обнаружения
специфических белков. IF может быть выполнена как на свежих, так и на фиксированных образцах. При IF антитела химически конъюгируют с флюоресцентными красителями, такими как флюоресцин изотиоционат (FITC) или тетраметил-родамин-изотиоционат (TRITC). Эти меченные антитела связываются (прямым или непрямым способом) с интересующим нас антигеном, что позволяет обнаружить его с помощью флюоресценции. Флюоресценция может быть количественно измерена с использованием проточного цитометра, матричного сканера или другого автоматиче-
ского прибора или же визу-
ализирована с использо- Первичное антитело
Прямая иммунофлюуресценция
ванием флюоресцентной или конфокальной микро-
скопии. |
Флюорохром |
|
Клетка |
||
С у щ е с т в у е т д в а |
||
Непрямая |
||
метода иммунофлюорес- |
||
иммунофлюуресценция |
||
ценции – прямой и непрямой. |
||
|
||
Реже используется прямой |
Вторичное антитело |
|
|
||
метод, при котором само |
|
|
антитело против интересу- |
|
ющего белка (первичное) Рис.10.1.Схематическоеизображениепрямойинепрямойиммунофлюоресценции.
химически конъюгиро - вано с флюоресцентным
красителем. При непрямой IF, антитело первичное не имеет метки, а метку несет второе антииммуноглобулиновое антитело, направленное против определенной части молекулы первичного антитела (вторичное антитело) (рис. 10.1).
Преимущества прямой IF. Более короткое время окрашивания образцов, простота двойной и тройной окраски. При использовании антител, полученных от одного вида, например два моноклональных мышиных, необходимо применять прямой метод окраски.
Недостатки прямой IF. Слабый сигнал, более высокая стоимость, меньшая гибкость и трудности в процедуре, если недоступны промышленно помеченные конъюгаты.
Преимущества непрямой IF. Более высокая чувствительность, чем у прямой IF. Амплификация сигнала при непрямой IF наблюдается из-за того, что с одним первичным антителом может
соединиться более чем одно вторичное (рис. 10.1). Коммерчески доступные вторичные антитела
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 97
Иммунофлюоресценция |
Глава 10 |
|
|
относительно дешевле, доступна широкая гамма цветов, легче производится контроль качества (рис. 10.2).
Недостатки непрямой IF. Потенциальная кроссреактивность; при постановке мультиокрасок необходимо искать антитела разных видов или разных изотипов. Образцы с эндогенным иммуноглобулином могут иметь значительное фоновое окрашивание.
Рис. 10. 2. Культура клеток эндотелия легочной артерии, окрашенных тубулином (красный), актином (зеленый) и ДНК (синий). Методика двойной иммунофлюоресценции с использованием кроличьих антител класса IgG к актину и мышиных антител класса IgG к тубулину в качестве первичных антител. В качестве вторичных антител к IgG кролика использовались козьи антитела, конъюгированные с техасским красным, в качестве вторичных антител к мышиным IgG использовались козьи антитела, конъюгированные с FITC. Образец также был докрашен красителем, специфичным к ДНК – Hoechst 33342. Шкала 20 мкм.
Излучение
Возбуждение
Спектр поглощения голубой Спектр излучение зеленый Ядро
Рис. 10.3. Принцип флюоресценции.
Принцип флюоресценции
Флюоресценция как и фосфоресценция являются подтипами люминесценции. После того как люминесцентная молекула поглощает свет,
она может испустить другое излучение соответствующей длины волны (рис.10.3). При флюоресценции излучение света происходит сразу же после возбуждения поглощенным светом, тогда как при фосфоресценции излучение продолжается еще несколько миллисекунд после того, как источник энергии был убран. Флюоресцентные
материалы способны излучать свет благодаря
их атомной структуре. Электроны находятся на дискретных энергетических уровнях, окружающих ядро атома, и каждый уровень имеет предопределенную энергию. Возбужденное состояние продолжается недолго. Время полужизни электрона в возбужденном состоянии обычно менее
10 секунд [8]. Электрон теряет небольшое коли-
98 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/