2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdf
Глава 21 |
|
Устранение неисправностей |
|||
|
|
|
|
|
|
Возможная причина |
|
Решение |
|
Страницы |
|
Использование неподходящего |
|
Проверьте указания производителя |
|
53-59 |
|
|
|
|
|||
фиксатора. |
|
касательно рекомендуемого фиксатора. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Использование неподходя- |
|
|
|
|
|
щего фиксатора может повре- |
|
|
|
|
|
дить или разрушить антигены |
|
|
|
|
|
или эпитопы в образце ткани. |
|
|
|
|
|
Использование non-cross linking |
|
|
|
|
|
fi xative может привести к вымы- |
|
|
|
|
|
ванию антигенов в растворах |
|
|
|
|
|
IHC реагентов. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Использование разных фикса- |
|
|
|
53-59, |
|
торов может повлиять на стан- |
|
|
|
45-52 |
|
дартизацию. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Нарушение |
|
Температура парафина при заливке ~ |
|
53-59 |
|
иммунореактивности или |
|
55-58 °С. Температура парафина не должна |
|
|
|
повреждение при заливке. |
|
превышать 60 °С |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Снижение иммунореактивности |
|
Температура термостата не должна |
|
53-59 |
|
или разрушение эпитопов в |
|
превышать 60°С. |
|
|
|
процессе депарафинирования |
|
ВАЖНО: интенсивность |
|
|
|
при высокой температуре. |
|
иммуногистохимической окраски может |
|
|
|
|
|
быть ниже из-за увеличения времени |
|
|
|
|
|
температурной обработки тканей. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Разрушение или инактивация |
|
Интенсивность иммунного окрашивания |
|
53-59 |
|
эпитопов в процессе предвари- |
|
может быть снижена, если предварительно |
|
|
|
тельной обработки ткани. |
|
нарезанные срезы передержаны на воздухе. |
|
|
|
|
|
Используйте свежие срезы и перезаливайте |
|
|
|
|
|
блоки при длительном хранении. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Снижение иммунореактивности |
|
Более характерно для замороженных срезов: |
|
53-59, 166 |
|
или разрушение эпитопов из-за |
|
применение первичных антител до фермент- |
|
|
|
взаимодействия фермент- |
|
ного блока для уверенности в результате. В |
|
|
|
ного блока и специфического |
|
таких случаях блокирующие реагенты можно |
|
|
|
эпитопа. |
|
применять на любом этапе реакции после |
|
|
|
|
|
нанесения первичных антител до нанесения |
|
|
|
|
|
меченных компонентов |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ткань обработали слишком |
|
Повторите окрашивании, убедившись в |
|
29-31 |
|
большим количеством промы- |
|
удалении избытка промывочного буфера и |
|
|
|
вочного буфера или блокиру- |
|
блокирующих сывороток. |
|
|
|
ющей сыворотки перед исполь- |
|
|
|
|
|
зованием IHC реагентов. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Протокол демаскировки анти- |
|
Некоторые антигены требуют протеолитиче- |
|
53-59, |
|
генов не подходит или упрощен. |
|
ской обработки или температурной активации |
|
80-104 |
|
|
|
перед окрашиванием. |
|
|
|
|
|
Необходимость предварительной обработки |
|
|
|
|
|
определяется типом и степенью фиксации, |
|
|
|
|
|
специфическими характеристиками антигена |
|
|
|
|
|
и типом используемых антител. Используйте |
|
|
|
|
|
метод обработки ткани, рекомендуемый |
|
|
|
|
|
производителем антител. Универсального |
|
|
|
|
|
метода, подходящего для всех случаев, нет. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 199
Устранение неисправностей |
|
Глава 21 |
|
|
|
|
|
Возможная причина |
Решение |
Страницы |
|
|
|
|
|
Повторное использование |
Не используйте буфер повторно. |
Специ- |
|
буфера для демаскировки |
|
фикация |
|
антигена. |
|
|
|
|
|
|
|
Неверное депарафинирование |
Приготовьте свежие срезы и проведите депа- |
166-176 |
|
срезов. |
рафинирование по протоколу лаборатории, |
|
|
|
используя свежий ксилол или его заменители. |
|
|
|
|
|
|
Ошибка в достижении опти- |
• При использовании водяной бани или стри- |
80-104 |
|
мальной температуры, необхо- |
мера, дождитесь нагревания буфера для дема- |
|
|
димой для демаскировки анти- |
скировки до 95-99°С. |
|
|
гена. |
• На большой высоте (более ~1370 м) буфер |
|
|
|
кипит при температуре ниже 95 °С. |
|
|
|
• Использование замкнутых нагревающих |
|
|
|
систем, таких как ретривер, автоклав или |
|
|
|
Pascal, или низкотемпературных протоколов, |
|
|
|
если стандартизация процедуры валидации |
|
|
|
не выполнена. |
|
|
|
|
|
|
Неравномерное или неполное |
Проверьте концентрацию дополнительного |
81-104 |
|
докрашивание. |
красителя и время инкубации. |
|
|
|
|
|
|
Плохая работа инструментов. |
Убедитесь, что автостейнер правильно запро- |
Специ- |
|
|
граммирован и работает по спецификациям |
фикация |
|
|
завода-производителя. |
|
|
|
|
|
|
Ткани положительного контроля окрашиваются правильно, фон слабый или отсутствует. Исследуемый образец окрашивается слабо или не окрашивается вовсе при выраженном фоновом окрашивании различных элементов ткани.
Возможная причина |
Пути устранения |
|
Страницы |
|
Препарат долго обрабаты- |
Стандартизуйте |
процесс фиксации. |
80-104 |
|
вался фиксатором, повыша- |
Протеолитическая обработка разрушает пере- |
|
||
ющим перекрестные взаимо- |
крестные связи и в некоторых случаях помо- |
|
||
действия, чаще формалином, |
гает демаскировать антигены. Обратитесь к |
|
||
что обусловило маскирование |
инструкции первичных антител за дополни- |
|
||
антигенных детерминант из-за |
тельной информацией. |
|
||
перекрестных альдегидных |
|
|
|
|
взаимодействий и повешенной |
|
|
|
|
гидрофобности ткани. |
|
|
|
|
|
|
|
||
Исследуемый образец содержит |
Белки плазмы диффундируют в ткань и |
166-176 |
||
артефакты размозжения ткани |
фиксируются. Сделайте новый срез острым |
|
||
из-за использования тупого |
инструментом. |
|
|
|
ножа или скальпеля. |
|
|
|
|
|
|
|
||
Ткань в срезе некротизирована |
Не обращайте внимания на поврежденные |
80-104 |
||
или повреждена другим способом. |
участки ткани в окрашенном препарате. |
|
||
|
|
|
||
Область среза недостаточно |
Фиксируйте образцы ткани дольше или |
53-59, |
||
зафиксирована. Нефикси- |
выбирайте куски |
меньшего размера. |
166-176, |
|
рованная ткань потеряла анти- |
Незафиксированная ткань неспецифически |
|||
|
||||
генные свойства. |
взаимодействует со всеми реагентами. |
См. |
||
|
|
|
также |
|
|
|
|
80-85 |
|
|
|
|
|
|
200 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 21 |
Устранение неисправностей |
|
|
Общий фон
В контрольных и исследуемых образцах тканей регистрируется фоновое окрашивание. В некоторых тканевых структурах фоновое окрашивание может быть выраженным, например, в жировой, соединительной ткани, в эпителии.
Возможная причина |
Пути решения |
Страницы |
|
Слишком длительная инку- |
Уменьшить время инкубации. |
Инструкция |
|
бация с хромогеном. |
|
по приме- |
|
|
|
нению |
|
|
|
|
|
Хромоген-субстрат непра- |
Повторите окрашивание, используя правильно |
Инструкция |
|
вильно приготовлен. |
приготовленный хромоген. |
по приме- |
|
|
|
нению |
|
|
|
|
|
Вторичные или меченые анти- |
Абсорбируйте меченые антитела экстрактом |
91-96 |
|
тела перекрестно реагируют с |
белка ткани или цельной видоспецифичной |
|
|
сывороткой животного-донора. |
|
||
антигенами ткани. |
|
||
|
|
||
|
|
|
|
Вторичные или меченые анти- |
Повторите окрашивание. Подберите опти- |
29-31 |
|
тела и/или третичные реагенты |
мальную концентрацию каждого реактива. |
|
|
Время и температура инкубации также влияют |
|
||
слишком концентрированы. |
|
||
на результат реакции. Чтобы выбрать опти- |
|
||
|
|
||
|
мальный протокол окраски, меняйте темпе- |
|
|
|
ратуру и время инкубации каждого реактива. |
|
|
|
|
|
|
Препараты недостаточно |
Осторожно промывайте образцы из бутыли |
22-23 |
|
промываются. |
с промывочным буфером и оставляйте их в |
|
|
промывочной ёмкости на 5 минут. Аккуратное |
|
||
|
|
||
|
полоскание в промывочном буфере может |
|
|
|
увеличить эффективность при работе с цито- |
|
|
|
плазматическими или ядерными антигенами. |
|
|
|
|
|
|
В промывочном буфере недо- |
При использовании высокочувствительных |
166-176 |
|
статочно солей или детер- |
систем детекции может потребоваться исполь- |
|
|
зование высоких концентраций детергентов |
|
||
гентов. |
|
||
или солей в промывочном буфере. Обратитесь |
|
||
|
|
||
|
к инструкции системы детекции для выбора |
|
|
|
оптимальных концентраций солей. |
|
|
|
|
|
|
Некачественное блокирование |
В качестве блокирующей, используйте сыво- |
166-176 |
|
активности эндогенных белков |
ротку животного, донора вторичный антител. |
|
|
Не пользуйтесь сывороткой, содержащей |
|
||
ткани |
|
||
аутоиммунные иммуноглобулины. В качестве |
|
||
|
|
||
|
альтернативы можно использовать бессыво- |
|
|
|
роточный блокатор белков, не содержащий |
|
|
|
иммуноглобулинов. |
|
|
|
|
|
|
Неправильно депарафиниро- |
Сделайте новые срезы и депарафинируйте |
166-176 |
|
ванные срезы. |
их по стандартному протоколу лаборатории, |
|
|
используя свежий ксилол. |
|
||
|
|
||
|
|
|
|
Неспецифическое связывание |
Используйте вторичные антител, абсорбиро- |
91-96, |
|
вторичных антител с образцом |
ванные против вида образца или |
смотрите |
|
|
также |
||
ткани животного. |
|
||
|
166-176 |
||
|
|
||
|
|
|
|
Неисправности |
Убедитесь в том, что стейнер правильно запро- |
Инструкция |
|
оборудования. |
граммирован и работает по инструкции произ- |
произво- |
|
водителя. |
дителя |
||
|
|||
|
|
|
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 201
Устранение неисправностей |
Глава 21 |
|
|
Фон регистрируется в исследуемом образце и в отрицательном контроле. В тканях отрицательного и положительного контроля окрашивание специфично. Некоторые тканевые структуры могут быть вовлечены, например, соединительная ткань, жировая, эпителий.
Возможная причина |
Решение |
Страницы |
Препарат слишком долго |
Стандартизуйте процесс фиксации. |
53-59 |
обрабатывался фиксатором, |
Протеолитическая обработка разру- |
|
повышающим перекрестные |
шает перекрестные связи и в некоторых |
|
взаимодействия, чаще форма- |
случаях помогает демаскировать антигены. |
|
лином, что обусловило |
Обратитесь к инструкции первичных антител |
|
«маскирование» антигенных |
за дополнительной информацией. |
|
детерминант из-за пере- |
|
|
крестных альдегидных взаи- |
|
|
модействий и повешенной |
|
|
гидрофобности ткани. |
|
|
|
|
|
Образец ткани недоста- |
Фиксируйте образцы ткани дольше или |
53-59 |
точно зафиксировался. |
формируйте куски меньшего размера, чтобы |
|
Нефиксированная ткань |
быть уверенными в том, что они зафиксиру- |
|
утратила антигенные свой- |
ются. |
|
ства. Нефиксированная ткань |
|
|
неспецифично реагирует со |
|
|
всеми реагентами. |
|
|
|
|
|
Исследуемый образец |
Сделайте новый срез острым инструментом. |
166-176 |
содержит артефакты размоз- |
|
|
жения ткани из-за исполь- |
|
|
зования тупого ножа или |
|
|
скальпеля. Белки плазмы |
|
|
диффундируют в ткань и |
|
|
фиксируются. |
|
|
|
|
|
Ткань в срезе некротизиро- |
Не обращайте внимания на поврежденные |
166-176 |
вана или иначе повреждена. |
участки ткани в окрашенном препарате. |
|
|
|
|
|
|
|
Чрезмерное или неправильное |
Некоторые реактивы для IHC могут взаимо- |
166-176 |
нанесение поли-L-лизина на |
действовать с этими продуктами, приводя к |
|
предметное стекло, заря- |
слабому окрашиванию на всей поверхности |
|
женное или силанизированое |
препарата. Некоторые препараты могут |
|
стекло. |
быть неправильно накрыты, в этом случае |
|
|
описанные изменения отмечаются только в |
|
|
части препарата или ткани. |
|
|
|
|
Диффузия антигена до |
Время между взятием образца до погру- |
166-176 |
фиксации ткани, обуслов- |
жения в фиксатор должнго быть насколько |
|
ливая специфическое |
|
|
возможно минимальным. |
|
|
фоновое окрашивание за |
|
|
|
|
|
пределами ожидаемого |
|
|
участка. |
|
|
|
|
|
Срез слишком толстый. |
Сделайте более тонкие срезы. Срезы ткани |
53-59 |
|
должны быть примерно 4-6 μm. |
|
|
|
|
Фон в препарате отрицательного контроля. Окрашивание в препаратах положительного
контроля, отрицательного контроля и исследуемого образца специфично.
202 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 21 |
|
Устранение неисправностей |
||
|
|
|
|
|
Возможная причина |
|
Пути решения |
|
Страницы |
Недостаточное разведение сыво- |
|
Используйте правильно разведенную сыворотку |
|
183-188 |
|
|
|||
ротки отрицательного контроля. |
|
• Для поликлональных антител, сыворотку от- |
|
|
|
|
рицательного контроля разводят до тех пор, |
|
|
|
|
пока концентрация белка не сравняется с |
|
|
|
|
концентрацией первичных антител. |
|
|
|
|
• Для моноклональных антител, сыворотку от- |
|
|
|
|
рицательного контроля разводят до тех пор, |
|
|
|
|
пока концентрация Ig не сравняется с концен- |
|
|
|
|
трацией Ig в сыворотке первичных антител. |
|
|
|
|
|
|
|
Примеси антител в сыворотке отрица- |
|
Замените сыворотку отрицательного |
|
183-188 |
тельного контроля перекрестно реаги- |
|
контроля; повторите окрашивание. |
|
|
руют с белками ткани. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Реагенты отрицательного контроля |
|
Замените сыворотку чистой. |
|
25-26 |
загрязнены бактериями или грибами. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ограниченное фоновое окрашивание
Участки неверного окрашивания контролей, исследуемого образца и предметного стекла.
Возможная причина |
|
|
Пути решения |
|
Страницы |
Белок, попавший |
под срез |
|
Не используйте загрязненные адгезивы, крах- |
|
80-104, |
|
|
||||
при монтировании препарата, |
|
мальный клей или желатин в водяных банях |
|
166-176 |
|
приподнимает ткань, из-за чего |
|
при монтировании препаратов. Не позво- |
|
||
|
|
|
|||
IHC реагенты могут затекать |
|
ляйте воде с одного среза стекать на место |
|
|
|
под образец или ткань может |
|
монтирования следующего среза, особенно |
|
|
|
частично отслоиться от пред- |
|
при использовании заряженных или силани- |
|
|
|
метного стекла. |
|
|
зированных стекол при размещении срезов с |
|
|
|
|
|
нескольких разных блоков на одном стекле. |
|
|
|
|
|
|
|
|
Нерастворенные |
гранулы |
|
Убедитесь, что хромоген в таблетках или |
|
166-176 |
хромогена. |
|
|
порошке полностью растворяется или исполь- |
|
|
|
|
|
зуйте жидкий хромоген. |
|
|
|
|
|
|
|
|
Неполное удаление заливочной |
|
Полностью удалите заливочную среду, |
|
166-176 |
|
среды. |
|
|
используя свежие реагенты. |
|
|
|
|
|
|
|
|
Неполная dezenkerization*, тканей, |
|
Повторите процедуру со свежими реагентами. |
|
53-59 |
|
фиксированных с помощью B5 или |
|
|
|
|
|
ртуть-содержащих препаратов. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Загрязнение водяной бани |
|
Почистите и заново наполните водяную баню. |
|
166-176 |
|
бактериями или дрожжами. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Частичное высыхание ткани до |
|
• Быстро погрузите ткань в фиксатор или кон- |
|
166-176 |
|
фиксации. Неповрежденные |
|
сервирующий реагент. |
|
|
|
области окрашены нормально. |
|
• Поддерживайте ткань влажной во время про- |
|
|
|
|
|
|
цедуры окраски. |
|
|
|
|
|
• Используйте влажную камеру при окрашивании. |
|
|
|
|
|
• При использовании автостейнеров, можно ис- |
|
|
|
|
|
пользовать влажные полотенца для предот- |
|
|
|
|
|
вращения подсыхания препаратов (подло- |
|
|
|
|
|
жить полотенце под слив). |
|
|
|
|
|
|
|
|
Неисправности оборудования. |
|
Убедитесь в том, что стейнер правильно |
|
Инструкция |
|
|
|
|
запрограммирован и работает по инструкции |
|
произво- |
|
|
|
производителя. |
|
дителя |
|
|
|
|
|
|
*«De-zenk» – «dezenkerization» – использование соединений йода для удаления пигмента ртути
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 203
Устранение неисправностей |
Глава 21 |
|
|
Жировая или соединительная ткань образца, ткани отрицательного контроля, ткань положи-
тельного контроля и препараты реагентов отрицательного контроля. Фон в жировой ткани и эпителии.
Возможная причина |
|
Пути решения |
|
Страницы |
Гидрофобные или ионные взаи- |
|
Неспецифическое окрашивание жировой |
|
166-176 |
|
|
|||
модействия между иммуногло- |
|
ткани редко влияет на интерпретацию резуль- |
|
|
булинами и липидами жировой |
|
тата, в большинстве случаев, его можно игно- |
|
|
ткани. |
|
рировать. |
|
|
|
|
|
|
|
Недостаточное разведение |
|
Подберите оптимальное разведение |
|
29-31 |
первичных антител и сыворотки |
|
первичных антител и сыворотки отрицатель- |
|
|
отрицательного контроля. |
|
ного контроля. |
|
|
|
|
|
|
|
Эпителий образца, ткани отрицательного контроля, ткани положительного контроля и препараты реагентов отрицательного контроля. Окрашивание от умеренного до яркого, особенно в эпителии эпидермиса. Фоновое окрашивание эпителия и соединительной ткани.
Возможная причина |
|
Пути решения |
Страницы |
||
В первичных антителах и сыво- |
• Увеличьте разведение первичных антител |
20-22, |
|||
ротке отрицательного контроля |
166-176 |
||||
|
и сыворотки отрицательного контроля. |
||||
содержаться примеси антител |
|
|
|||
• |
Увеличьте время инкубации. |
|
|||
к эпителиа льной |
ткани, |
|
|||
• |
Поменяйте антитела. |
|
|||
возможно цитокератинам. |
|
||||
|
|
|
|||
|
|
|
|
||
Недостаточное разведение |
Подберите оптимальное разведение первичных |
53-59, |
|||
первичных антител и сыворотки |
166-176 |
||||
антител и сыворотки отрицательного контроля. |
|||||
отрицательного контроля. |
|
||||
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
Фокальное цитоплазматическое окрашивание в эпителии и образце ткани.
Возможная причина
Фокальное окрашивание цитоплазмы эпителия отмечается обычно в промежуточном или поверхностном слое эпидермиса. Это может быть обусловлено пассивной абсорбцией белков плазмы разрушающимися клетками эпидермиса.
Пути решения
Данное явление регистрируется редко и не влияет на интерпретацию специфического окрашивания ткани.
Страницы
166-176
Фоновое окрашивание регистрируется во всех контрольных и диагностических образцах ткани
при использовании иммунопероксидазной системы окраски.
Возможная причина
Во всех образцах, содержащих гемопротеины, в том числе, гемоглобин в эритроцитах, миоглобин в мышечных клетках, цитохром в гранулоцитах и моноцитах, каталазы калеток печени и почек, может проявляться неподавленная активность эндогенной пероксидазы.
Пути решения |
Страницы |
|
• |
Смените пероксидазный блок или |
166-176 |
|
увеличьте время инкубации ткани с ним |
|
|
или выберите другой фермент-метку, |
|
|
например, щелочную фосфатазу. |
|
• Эозинофилы и тучные клетки очень устой- |
|
|
|
чивы к подавлению пероксидазной актив- |
|
|
ности, используйте пероксидазный блок. |
|
• |
Используйте специфические окраски: |
|
|
эозин окрасит эозинофилы в яркий красно- |
|
|
оранжевый цвет. |
|
|
|
|
204 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 21 |
Устранение неисправностей |
|
|
Фоновое окрашивание регистрируется во всех контрольных и диагностических образцах ткани
при окрашивании с использованием щелочной фосфатазы.
Возможная причина
Неподавленная активность эндогенной щелочной фосфатазы может наблюдаться в лейкоцитах, почках, печени, костях, яичнике, мочевом пузыре, слюнных железах, плаценте, тканях желудочнокишечного тракта.
Пути решения |
Страницы |
Добавьте левомизоль к раствору хромо- |
166-176 |
|
|
гена щелочной фосфатазы или используйте |
|
другую систему детекции, например, перокси- |
|
дазу хрена. Активность щелочной фосфатазы |
|
тонкой кишки не подавляется левамизолем. |
|
Обработайте ткань 0,03N HCl. |
|
|
|
Фоновое окрашивание регистрируется во всех контрольных и диагностических образцах ткани
при применении стрептовидин-биотинового метода окрашивания.
Возможная причина |
|
Пути решения |
|
Страницы |
Эндогенный биотин, связанный |
|
Блокируйте активность эндогенного биотина |
|
166-176 |
|
|
|||
с белком (водорастворимый |
|
или используйте другую методику окраски. |
|
|
витамин В). Большое количество |
|
|
|
|
биотина обнаружено в надпочеч- |
|
|
|
|
никах, печени, почках. Меньше |
|
|
|
|
его в ЖКТ, легких, селезенке, |
|
|
|
|
поджелудочной железе, мозге, |
|
|
|
|
молочной железе, жировой |
|
|
|
|
ткани, лимфоидной ткани и |
|
|
|
|
клетках, культивированных на |
|
|
|
|
средах, содержащих биотин в |
|
|
|
|
качестве питательного вещества. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Фоновое окрашивание гладкой или скелетной мускулатуры в тканях положительного контроля,
исследуемом образце и при реакции с сывороткой отрицательного контроля.
Возможная причина
Причина неясна. Возможно, это обусловлено антителами к мышечным антигенам в сыворотках первичных антител и отрицательного контроля.
Пути решения |
Страницы |
Не должно повлиять на интерпретацию специ- |
166-176 |
фического окрашивания. |
|
|
|
Неожиданное «специфическое» окрашивание
Положительное окрашивание мембран лейкоцитов в исследуемом образце, положительном
контроле и при реакции с сывороткой отрицательного контроля.
Возможная причина
Связывание Fcфрагмента Ig с Fc рецептором на мембране клеток макрофагов, моноцитов, гранулоцитов и некоторых лимфоцитов.
|
Пути решения |
Страницы |
• |
Используйте F(ab1)2 или F(ab) фрагменты |
166-176 |
|
первичных и вторичных антител вместо |
|
|
цельных антител. |
|
• |
Добавьте детергент в промывочный буфер. |
|
|
|
|
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 205
Устранение неисправностей |
Глава 21 |
|
|
Положительное окрашивание только гистиоцитов и гранулоцитов в образце ткани, ненормальное
взаимодействие с этими клетками.
Возможная причина |
Пути решения |
Страницы |
Фагоцитоз антигенов может |
Встречается редко. Не должно повлиять на |
166-176 |
|
||
вызвать окрашивание фагоцитов. |
интерпретацию специфического окрашивания. |
|
|
|
|
Положительное мембранное окрашивание образца и ткани отрицательного контроля при исполь-
зовании пероксидазы хрена.
Возможная причина |
|
Пути решения |
|
Страницы |
Ткани пациентов, инфициро- |
|
Используйте непероксидазный метод окраски. |
|
166-176 |
|
|
|||
ванных вирусом гепатита В |
|
|
|
|
и экспрессирующие поверх- |
|
|
|
|
ностный антиген гепатита В могут |
|
|
|
|
окрашиваться нежелательно. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Разное
Утрата жизнеспособности структур клетки.
Возможная причина
Некоторые производители изготавливают антитела только для использования in vitro. В этих продуктах могут содержаться ядовитые концентраты, обычно, азид натрия.
Пути решения |
Страницы |
Для исследования живых клеток исполь- |
166-176 |
зуйте продукцию с маркировкой in vivo. Только |
|
при работе с культурой клеток: из неко- |
|
торых реагентов азид натрия можно удалить |
|
(диализом). Для получения дополнительной |
|
информации свяжитесь с группой технической |
|
поддержки Dako. |
|
|
|
206 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 21 |
Устранение неисправностей |
|
|
Второй раздел
Технологическая схема устранения неполадок: используйте эту схему для определения причин
неспецифического окрашивания при использовании протокола иммуногистохимической окраски.
Фоновое окрашивание, встречающееся при использовании реагентов пероксидазы.
Реагент
|
|
|
|
|
№1 |
|
Ткань положительного контроля: |
|
Препарат |
|
|
|
|
докрашивание гематоксилином |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
НЕТ ОКРАШИВАНИЯ. |
|
|
ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ |
|
|
|
|
|
Результат/действие
Обнаружение коричневого пигмента (как меланин):
Можно использовать азур В для того, чтобы отличить меланиновый пигмент и DAB хромогена. Меланин окрашивается сине-зеленым, DAB хромоген остается коричневым.
Можно использовать AEC в качестве хромогена. Если в ткани уровень пигмента высок, красный хромоген может быть частично подавлен. Так как протоколы обесцвечивания меланина могут нарушить антигенную структуру ткани, этой процедуры по возможности, лучше избегать.
|
|
|
|
|
№2 |
|
|
|
Препарат |
|
Ткань положительного контроля: |
|
|
|
|
|
|
|
DAB/AEC+докрашивание |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
НЕТ ОКРАШИВАНИЯ. |
|
|
ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ |
|
|
|
|
|
Коричневый/красный цвет:
Свидетельствует об эндогенной пероксидазной активности в ткани. Можно обнаружить во всех тканях, содержащих гемопротеин, в том числе, в эритроцитах, мышцах, печени, почках, гранулоцитах и моноцитах.
Блокируется с помощью 3% раствора перекиси водорода или других реактивов. Используя свежую перекись водорода, приготовьте блокатор эндогенной пероксидазы, трехпроцентный раствор H2O2, затем используйте DAB и докрасьте срез.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 207
Устранение неисправностей |
Глава 21 |
|
|
Реагент |
Результат/Действие |
|
|
|
|
|
№3 |
|
Ткань положительного контроля: |
|
Препарат |
|
|
|
|
пероксидазный блок+вторичные |
|
|
|
|
|
|
|
|
антитела+стрептовидин-HRP+DAB/ |
|
|
|
AEC+докрашивание |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
НЕТ ОКРАШИВАНИЯ. |
|
|
ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
№4 |
|
Пероксидазный блок+биотиновый |
|
Препарат |
|
блок (если требуется)+вторичный |
|
|
|
|
|
|
|
антитела+стрептовидин-HRP+DAB/ |
|
|
|
AEC+ докрашивание |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
НЕТ ОКРАШИВАНИЯ. |
|
|
ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
№5 |
|
|
Препарат |
Ткань положительного контроля |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.
ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ
Коричневый/красный цвет:
Указывает на эндогенную активность биотина в ткани. Биотин, связанный с белками, можно обнаружить в надпочечниках, печени, почках, ЖКТ, легком, селезенке, мозге, молочной железе, жировой ткани, лимфоидной ткани и культурах клеток, выращенных на биотине (RPMI, NCTC, MEME).
Блокируйте активность эндогенного биотина или поменяйте метод окраски на независящий от реакции биотин/стрептовидин.
Коричневый/красный цвет:
Указывает на неспецифическое или нежелательное связывание вторичных антител с антигенами ткани. Первично возникает, если вторичные антитела не подходят к использованию на специфических образцах ткани (например, биотинизированных антител в богатых биотином тканях).
Для решения этой проблемы абсорбируйте неспецифические антитела, добавлением 2,5 – 10,0 мкл нормальной сыворотки (того же животного, которое окрашивается) на 100 мкл вторичных антител.
Коричневый/красный цвет:
Может свидетельствовать о неспецифическом связывании белков-переносчиков первичных антител. Приготовьте протеиновый блок из нормальной сыворотки животного-донора меченных антител добавьте 0,05-0,1% TWEEN 20 к промывочному буферу чтобы снизить взаимодействие белков.
Может появиться липофусцин – артефакт температурной демаскировки антигенов, пылевидное окрашивание – в печени, тканях сердца, или как специфическое окрашивание срезов поджелудочной железы.
208 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/