Добавил:
kiopkiopkiop18@yandex.ru Вовсе не секретарь, но почту проверяю Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ

.pdf
Скачиваний:
3
Добавлен:
23.03.2024
Размер:
5.3 Mб
Скачать

Глава 21

 

Устранение неисправностей

 

 

 

 

 

 

Возможная причина

 

Решение

 

Страницы

Использование неподходящего

 

Проверьте указания производителя

 

53-59

 

 

 

 

фиксатора.

 

касательно рекомендуемого фиксатора.

 

 

 

 

 

 

 

 

Использование неподходя-

 

 

 

 

 

щего фиксатора может повре-

 

 

 

 

 

дить или разрушить антигены

 

 

 

 

 

или эпитопы в образце ткани.

 

 

 

 

 

Использование non-cross linking

 

 

 

 

 

fi xative может привести к вымы-

 

 

 

 

 

ванию антигенов в растворах

 

 

 

 

 

IHC реагентов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Использование разных фикса-

 

 

 

53-59,

 

торов может повлиять на стан-

 

 

 

45-52

 

дартизацию.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Нарушение

 

Температура парафина при заливке ~

 

53-59

 

иммунореактивности или

 

55-58 °С. Температура парафина не должна

 

 

 

повреждение при заливке.

 

превышать 60 °С

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Снижение иммунореактивности

 

Температура термостата не должна

 

53-59

 

или разрушение эпитопов в

 

превышать 60°С.

 

 

 

процессе депарафинирования

 

ВАЖНО: интенсивность

 

 

 

при высокой температуре.

 

иммуногистохимической окраски может

 

 

 

 

 

быть ниже из-за увеличения времени

 

 

 

 

 

температурной обработки тканей.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Разрушение или инактивация

 

Интенсивность иммунного окрашивания

 

53-59

 

эпитопов в процессе предвари-

 

может быть снижена, если предварительно

 

 

 

тельной обработки ткани.

 

нарезанные срезы передержаны на воздухе.

 

 

 

 

 

Используйте свежие срезы и перезаливайте

 

 

 

 

 

блоки при длительном хранении.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Снижение иммунореактивности

 

Более характерно для замороженных срезов:

 

53-59, 166

 

или разрушение эпитопов из-за

 

применение первичных антител до фермент-

 

 

 

взаимодействия фермент-

 

ного блока для уверенности в результате. В

 

 

 

ного блока и специфического

 

таких случаях блокирующие реагенты можно

 

 

 

эпитопа.

 

применять на любом этапе реакции после

 

 

 

 

 

нанесения первичных антител до нанесения

 

 

 

 

 

меченных компонентов

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ткань обработали слишком

 

Повторите окрашивании, убедившись в

 

29-31

 

большим количеством промы-

 

удалении избытка промывочного буфера и

 

 

 

вочного буфера или блокиру-

 

блокирующих сывороток.

 

 

 

ющей сыворотки перед исполь-

 

 

 

 

 

зованием IHC реагентов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Протокол демаскировки анти-

 

Некоторые антигены требуют протеолитиче-

 

53-59,

 

генов не подходит или упрощен.

 

ской обработки или температурной активации

 

80-104

 

 

 

перед окрашиванием.

 

 

 

 

 

Необходимость предварительной обработки

 

 

 

 

 

определяется типом и степенью фиксации,

 

 

 

 

 

специфическими характеристиками антигена

 

 

 

 

 

и типом используемых антител. Используйте

 

 

 

 

 

метод обработки ткани, рекомендуемый

 

 

 

 

 

производителем антител. Универсального

 

 

 

 

 

метода, подходящего для всех случаев, нет.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 199

Устранение неисправностей

 

Глава 21

 

 

 

 

Возможная причина

Решение

Страницы

 

 

 

 

Повторное использование

Не используйте буфер повторно.

Специ-

буфера для демаскировки

 

фикация

антигена.

 

 

 

 

 

 

 

Неверное депарафинирование

Приготовьте свежие срезы и проведите депа-

166-176

 

срезов.

рафинирование по протоколу лаборатории,

 

 

 

используя свежий ксилол или его заменители.

 

 

 

 

 

 

Ошибка в достижении опти-

• При использовании водяной бани или стри-

80-104

 

мальной температуры, необхо-

мера, дождитесь нагревания буфера для дема-

 

 

димой для демаскировки анти-

скировки до 95-99°С.

 

 

гена.

• На большой высоте (более ~1370 м) буфер

 

 

 

кипит при температуре ниже 95 °С.

 

 

 

• Использование замкнутых нагревающих

 

 

 

систем, таких как ретривер, автоклав или

 

 

 

Pascal, или низкотемпературных протоколов,

 

 

 

если стандартизация процедуры валидации

 

 

 

не выполнена.

 

 

 

 

 

 

Неравномерное или неполное

Проверьте концентрацию дополнительного

81-104

 

докрашивание.

красителя и время инкубации.

 

 

 

 

 

 

Плохая работа инструментов.

Убедитесь, что автостейнер правильно запро-

Специ-

 

граммирован и работает по спецификациям

фикация

 

завода-производителя.

 

 

 

 

 

 

Ткани положительного контроля окрашиваются правильно, фон слабый или отсутствует. Исследуемый образец окрашивается слабо или не окрашивается вовсе при выраженном фоновом окрашивании различных элементов ткани.

Возможная причина

Пути устранения

 

Страницы

Препарат долго обрабаты-

Стандартизуйте

процесс фиксации.

80-104

вался фиксатором, повыша-

Протеолитическая обработка разрушает пере-

 

ющим перекрестные взаимо-

крестные связи и в некоторых случаях помо-

 

действия, чаще формалином,

гает демаскировать антигены. Обратитесь к

 

что обусловило маскирование

инструкции первичных антител за дополни-

 

антигенных детерминант из-за

тельной информацией.

 

перекрестных альдегидных

 

 

 

взаимодействий и повешенной

 

 

 

гидрофобности ткани.

 

 

 

 

 

 

Исследуемый образец содержит

Белки плазмы диффундируют в ткань и

166-176

артефакты размозжения ткани

фиксируются. Сделайте новый срез острым

 

из-за использования тупого

инструментом.

 

 

ножа или скальпеля.

 

 

 

 

 

 

Ткань в срезе некротизирована

Не обращайте внимания на поврежденные

80-104

или повреждена другим способом.

участки ткани в окрашенном препарате.

 

 

 

 

Область среза недостаточно

Фиксируйте образцы ткани дольше или

53-59,

зафиксирована. Нефикси-

выбирайте куски

меньшего размера.

166-176,

рованная ткань потеряла анти-

Незафиксированная ткань неспецифически

 

генные свойства.

взаимодействует со всеми реагентами.

См.

 

 

 

также

 

 

 

80-85

 

 

 

 

200 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 21

Устранение неисправностей

 

 

Общий фон

В контрольных и исследуемых образцах тканей регистрируется фоновое окрашивание. В некоторых тканевых структурах фоновое окрашивание может быть выраженным, например, в жировой, соединительной ткани, в эпителии.

Возможная причина

Пути решения

Страницы

Слишком длительная инку-

Уменьшить время инкубации.

Инструкция

бация с хромогеном.

 

по приме-

 

 

нению

 

 

 

Хромоген-субстрат непра-

Повторите окрашивание, используя правильно

Инструкция

вильно приготовлен.

приготовленный хромоген.

по приме-

 

 

нению

 

 

 

Вторичные или меченые анти-

Абсорбируйте меченые антитела экстрактом

91-96

тела перекрестно реагируют с

белка ткани или цельной видоспецифичной

 

сывороткой животного-донора.

 

антигенами ткани.

 

 

 

 

 

 

Вторичные или меченые анти-

Повторите окрашивание. Подберите опти-

29-31

тела и/или третичные реагенты

мальную концентрацию каждого реактива.

 

Время и температура инкубации также влияют

 

слишком концентрированы.

 

на результат реакции. Чтобы выбрать опти-

 

 

 

 

мальный протокол окраски, меняйте темпе-

 

 

ратуру и время инкубации каждого реактива.

 

 

 

 

Препараты недостаточно

Осторожно промывайте образцы из бутыли

22-23

промываются.

с промывочным буфером и оставляйте их в

 

промывочной ёмкости на 5 минут. Аккуратное

 

 

 

 

полоскание в промывочном буфере может

 

 

увеличить эффективность при работе с цито-

 

 

плазматическими или ядерными антигенами.

 

 

 

 

В промывочном буфере недо-

При использовании высокочувствительных

166-176

статочно солей или детер-

систем детекции может потребоваться исполь-

 

зование высоких концентраций детергентов

 

гентов.

 

или солей в промывочном буфере. Обратитесь

 

 

 

 

к инструкции системы детекции для выбора

 

 

оптимальных концентраций солей.

 

 

 

 

Некачественное блокирование

В качестве блокирующей, используйте сыво-

166-176

активности эндогенных белков

ротку животного, донора вторичный антител.

 

Не пользуйтесь сывороткой, содержащей

 

ткани

 

аутоиммунные иммуноглобулины. В качестве

 

 

 

 

альтернативы можно использовать бессыво-

 

 

роточный блокатор белков, не содержащий

 

 

иммуноглобулинов.

 

 

 

 

Неправильно депарафиниро-

Сделайте новые срезы и депарафинируйте

166-176

ванные срезы.

их по стандартному протоколу лаборатории,

 

используя свежий ксилол.

 

 

 

 

 

 

Неспецифическое связывание

Используйте вторичные антител, абсорбиро-

91-96,

вторичных антител с образцом

ванные против вида образца или

смотрите

 

также

ткани животного.

 

 

166-176

 

 

 

 

 

Неисправности

Убедитесь в том, что стейнер правильно запро-

Инструкция

оборудования.

граммирован и работает по инструкции произ-

произво-

водителя.

дителя

 

 

 

 

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 201

Устранение неисправностей

Глава 21

 

 

Фон регистрируется в исследуемом образце и в отрицательном контроле. В тканях отрицательного и положительного контроля окрашивание специфично. Некоторые тканевые структуры могут быть вовлечены, например, соединительная ткань, жировая, эпителий.

Возможная причина

Решение

Страницы

Препарат слишком долго

Стандартизуйте процесс фиксации.

53-59

обрабатывался фиксатором,

Протеолитическая обработка разру-

 

повышающим перекрестные

шает перекрестные связи и в некоторых

 

взаимодействия, чаще форма-

случаях помогает демаскировать антигены.

 

лином, что обусловило

Обратитесь к инструкции первичных антител

 

«маскирование» антигенных

за дополнительной информацией.

 

детерминант из-за пере-

 

 

крестных альдегидных взаи-

 

 

модействий и повешенной

 

 

гидрофобности ткани.

 

 

 

 

 

Образец ткани недоста-

Фиксируйте образцы ткани дольше или

53-59

точно зафиксировался.

формируйте куски меньшего размера, чтобы

 

Нефиксированная ткань

быть уверенными в том, что они зафиксиру-

 

утратила антигенные свой-

ются.

 

ства. Нефиксированная ткань

 

 

неспецифично реагирует со

 

 

всеми реагентами.

 

 

 

 

 

Исследуемый образец

Сделайте новый срез острым инструментом.

166-176

содержит артефакты размоз-

 

 

жения ткани из-за исполь-

 

 

зования тупого ножа или

 

 

скальпеля. Белки плазмы

 

 

диффундируют в ткань и

 

 

фиксируются.

 

 

 

 

 

Ткань в срезе некротизиро-

Не обращайте внимания на поврежденные

166-176

вана или иначе повреждена.

участки ткани в окрашенном препарате.

 

 

 

 

 

 

Чрезмерное или неправильное

Некоторые реактивы для IHC могут взаимо-

166-176

нанесение поли-L-лизина на

действовать с этими продуктами, приводя к

 

предметное стекло, заря-

слабому окрашиванию на всей поверхности

 

женное или силанизированое

препарата. Некоторые препараты могут

 

стекло.

быть неправильно накрыты, в этом случае

 

 

описанные изменения отмечаются только в

 

 

части препарата или ткани.

 

 

 

 

Диффузия антигена до

Время между взятием образца до погру-

166-176

фиксации ткани, обуслов-

жения в фиксатор должнго быть насколько

 

ливая специфическое

 

возможно минимальным.

 

фоновое окрашивание за

 

 

 

пределами ожидаемого

 

 

участка.

 

 

 

 

 

Срез слишком толстый.

Сделайте более тонкие срезы. Срезы ткани

53-59

 

должны быть примерно 4-6 μm.

 

 

 

 

Фон в препарате отрицательного контроля. Окрашивание в препаратах положительного

контроля, отрицательного контроля и исследуемого образца специфично.

202 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 21

 

Устранение неисправностей

 

 

 

 

 

Возможная причина

 

Пути решения

 

Страницы

Недостаточное разведение сыво-

 

Используйте правильно разведенную сыворотку

 

183-188

 

 

ротки отрицательного контроля.

 

• Для поликлональных антител, сыворотку от-

 

 

 

 

рицательного контроля разводят до тех пор,

 

 

 

 

пока концентрация белка не сравняется с

 

 

 

 

концентрацией первичных антител.

 

 

 

 

• Для моноклональных антител, сыворотку от-

 

 

 

 

рицательного контроля разводят до тех пор,

 

 

 

 

пока концентрация Ig не сравняется с концен-

 

 

 

 

трацией Ig в сыворотке первичных антител.

 

 

 

 

 

 

 

Примеси антител в сыворотке отрица-

 

Замените сыворотку отрицательного

 

183-188

тельного контроля перекрестно реаги-

 

контроля; повторите окрашивание.

 

 

руют с белками ткани.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Реагенты отрицательного контроля

 

Замените сыворотку чистой.

 

25-26

загрязнены бактериями или грибами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ограниченное фоновое окрашивание

Участки неверного окрашивания контролей, исследуемого образца и предметного стекла.

Возможная причина

 

 

Пути решения

 

Страницы

Белок, попавший

под срез

 

Не используйте загрязненные адгезивы, крах-

 

80-104,

 

 

при монтировании препарата,

 

мальный клей или желатин в водяных банях

 

166-176

приподнимает ткань, из-за чего

 

при монтировании препаратов. Не позво-

 

 

 

 

IHC реагенты могут затекать

 

ляйте воде с одного среза стекать на место

 

 

под образец или ткань может

 

монтирования следующего среза, особенно

 

 

частично отслоиться от пред-

 

при использовании заряженных или силани-

 

 

метного стекла.

 

 

зированных стекол при размещении срезов с

 

 

 

 

 

нескольких разных блоков на одном стекле.

 

 

 

 

 

 

 

 

Нерастворенные

гранулы

 

Убедитесь, что хромоген в таблетках или

 

166-176

хромогена.

 

 

порошке полностью растворяется или исполь-

 

 

 

 

 

зуйте жидкий хромоген.

 

 

 

 

 

 

 

Неполное удаление заливочной

 

Полностью удалите заливочную среду,

 

166-176

среды.

 

 

используя свежие реагенты.

 

 

 

 

 

 

 

Неполная dezenkerization*, тканей,

 

Повторите процедуру со свежими реагентами.

 

53-59

фиксированных с помощью B5 или

 

 

 

 

ртуть-содержащих препаратов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Загрязнение водяной бани

 

Почистите и заново наполните водяную баню.

 

166-176

бактериями или дрожжами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Частичное высыхание ткани до

 

• Быстро погрузите ткань в фиксатор или кон-

 

166-176

фиксации. Неповрежденные

 

сервирующий реагент.

 

 

области окрашены нормально.

 

• Поддерживайте ткань влажной во время про-

 

 

 

 

 

цедуры окраски.

 

 

 

 

 

• Используйте влажную камеру при окрашивании.

 

 

 

 

 

• При использовании автостейнеров, можно ис-

 

 

 

 

 

пользовать влажные полотенца для предот-

 

 

 

 

 

вращения подсыхания препаратов (подло-

 

 

 

 

 

жить полотенце под слив).

 

 

 

 

 

 

 

Неисправности оборудования.

 

Убедитесь в том, что стейнер правильно

 

Инструкция

 

 

 

запрограммирован и работает по инструкции

 

произво-

 

 

 

производителя.

 

дителя

 

 

 

 

 

 

*«De-zenk» – «dezenkerization» – использование соединений йода для удаления пигмента ртути

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 203

Устранение неисправностей

Глава 21

 

 

Жировая или соединительная ткань образца, ткани отрицательного контроля, ткань положи-

тельного контроля и препараты реагентов отрицательного контроля. Фон в жировой ткани и эпителии.

Возможная причина

 

Пути решения

 

Страницы

Гидрофобные или ионные взаи-

 

Неспецифическое окрашивание жировой

 

166-176

 

 

модействия между иммуногло-

 

ткани редко влияет на интерпретацию резуль-

 

 

булинами и липидами жировой

 

тата, в большинстве случаев, его можно игно-

 

 

ткани.

 

рировать.

 

 

 

 

 

 

 

Недостаточное разведение

 

Подберите оптимальное разведение

 

29-31

первичных антител и сыворотки

 

первичных антител и сыворотки отрицатель-

 

 

отрицательного контроля.

 

ного контроля.

 

 

 

 

 

 

 

Эпителий образца, ткани отрицательного контроля, ткани положительного контроля и препараты реагентов отрицательного контроля. Окрашивание от умеренного до яркого, особенно в эпителии эпидермиса. Фоновое окрашивание эпителия и соединительной ткани.

Возможная причина

 

Пути решения

Страницы

В первичных антителах и сыво-

• Увеличьте разведение первичных антител

20-22,

ротке отрицательного контроля

166-176

 

и сыворотки отрицательного контроля.

содержаться примеси антител

 

 

Увеличьте время инкубации.

 

к эпителиа льной

ткани,

 

Поменяйте антитела.

 

возможно цитокератинам.

 

 

 

 

 

 

 

 

Недостаточное разведение

Подберите оптимальное разведение первичных

53-59,

первичных антител и сыворотки

166-176

антител и сыворотки отрицательного контроля.

отрицательного контроля.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Фокальное цитоплазматическое окрашивание в эпителии и образце ткани.

Возможная причина

Фокальное окрашивание цитоплазмы эпителия отмечается обычно в промежуточном или поверхностном слое эпидермиса. Это может быть обусловлено пассивной абсорбцией белков плазмы разрушающимися клетками эпидермиса.

Пути решения

Данное явление регистрируется редко и не влияет на интерпретацию специфического окрашивания ткани.

Страницы

166-176

Фоновое окрашивание регистрируется во всех контрольных и диагностических образцах ткани

при использовании иммунопероксидазной системы окраски.

Возможная причина

Во всех образцах, содержащих гемопротеины, в том числе, гемоглобин в эритроцитах, миоглобин в мышечных клетках, цитохром в гранулоцитах и моноцитах, каталазы калеток печени и почек, может проявляться неподавленная активность эндогенной пероксидазы.

Пути решения

Страницы

Смените пероксидазный блок или

166-176

 

увеличьте время инкубации ткани с ним

 

 

или выберите другой фермент-метку,

 

 

например, щелочную фосфатазу.

 

• Эозинофилы и тучные клетки очень устой-

 

 

чивы к подавлению пероксидазной актив-

 

 

ности, используйте пероксидазный блок.

 

Используйте специфические окраски:

 

 

эозин окрасит эозинофилы в яркий красно-

 

 

оранжевый цвет.

 

 

 

 

204 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 21

Устранение неисправностей

 

 

Фоновое окрашивание регистрируется во всех контрольных и диагностических образцах ткани

при окрашивании с использованием щелочной фосфатазы.

Возможная причина

Неподавленная активность эндогенной щелочной фосфатазы может наблюдаться в лейкоцитах, почках, печени, костях, яичнике, мочевом пузыре, слюнных железах, плаценте, тканях желудочнокишечного тракта.

Пути решения

Страницы

Добавьте левомизоль к раствору хромо-

166-176

 

гена щелочной фосфатазы или используйте

 

другую систему детекции, например, перокси-

 

дазу хрена. Активность щелочной фосфатазы

 

тонкой кишки не подавляется левамизолем.

 

Обработайте ткань 0,03N HCl.

 

 

 

Фоновое окрашивание регистрируется во всех контрольных и диагностических образцах ткани

при применении стрептовидин-биотинового метода окрашивания.

Возможная причина

 

Пути решения

 

Страницы

Эндогенный биотин, связанный

 

Блокируйте активность эндогенного биотина

 

166-176

 

 

с белком (водорастворимый

 

или используйте другую методику окраски.

 

 

витамин В). Большое количество

 

 

 

 

биотина обнаружено в надпочеч-

 

 

 

 

никах, печени, почках. Меньше

 

 

 

 

его в ЖКТ, легких, селезенке,

 

 

 

 

поджелудочной железе, мозге,

 

 

 

 

молочной железе, жировой

 

 

 

 

ткани, лимфоидной ткани и

 

 

 

 

клетках, культивированных на

 

 

 

 

средах, содержащих биотин в

 

 

 

 

качестве питательного вещества.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Фоновое окрашивание гладкой или скелетной мускулатуры в тканях положительного контроля,

исследуемом образце и при реакции с сывороткой отрицательного контроля.

Возможная причина

Причина неясна. Возможно, это обусловлено антителами к мышечным антигенам в сыворотках первичных антител и отрицательного контроля.

Пути решения

Страницы

Не должно повлиять на интерпретацию специ-

166-176

фического окрашивания.

 

 

 

Неожиданное «специфическое» окрашивание

Положительное окрашивание мембран лейкоцитов в исследуемом образце, положительном

контроле и при реакции с сывороткой отрицательного контроля.

Возможная причина

Связывание Fcфрагмента Ig с Fc рецептором на мембране клеток макрофагов, моноцитов, гранулоцитов и некоторых лимфоцитов.

 

Пути решения

Страницы

Используйте F(ab1)2 или F(ab) фрагменты

166-176

 

первичных и вторичных антител вместо

 

 

цельных антител.

 

Добавьте детергент в промывочный буфер.

 

 

 

 

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 205

Устранение неисправностей

Глава 21

 

 

Положительное окрашивание только гистиоцитов и гранулоцитов в образце ткани, ненормальное

взаимодействие с этими клетками.

Возможная причина

Пути решения

Страницы

Фагоцитоз антигенов может

Встречается редко. Не должно повлиять на

166-176

 

вызвать окрашивание фагоцитов.

интерпретацию специфического окрашивания.

 

 

 

 

Положительное мембранное окрашивание образца и ткани отрицательного контроля при исполь-

зовании пероксидазы хрена.

Возможная причина

 

Пути решения

 

Страницы

Ткани пациентов, инфициро-

 

Используйте непероксидазный метод окраски.

 

166-176

 

 

ванных вирусом гепатита В

 

 

 

 

и экспрессирующие поверх-

 

 

 

 

ностный антиген гепатита В могут

 

 

 

 

окрашиваться нежелательно.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Разное

Утрата жизнеспособности структур клетки.

Возможная причина

Некоторые производители изготавливают антитела только для использования in vitro. В этих продуктах могут содержаться ядовитые концентраты, обычно, азид натрия.

Пути решения

Страницы

Для исследования живых клеток исполь-

166-176

зуйте продукцию с маркировкой in vivo. Только

 

при работе с культурой клеток: из неко-

 

торых реагентов азид натрия можно удалить

 

(диализом). Для получения дополнительной

 

информации свяжитесь с группой технической

 

поддержки Dako.

 

 

 

206 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 21

Устранение неисправностей

 

 

Второй раздел

Технологическая схема устранения неполадок: используйте эту схему для определения причин

неспецифического окрашивания при использовании протокола иммуногистохимической окраски.

Фоновое окрашивание, встречающееся при использовании реагентов пероксидазы.

Реагент

 

 

 

 

 

№1

 

Ткань положительного контроля:

 

Препарат

 

 

 

докрашивание гематоксилином

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.

 

 

ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

 

 

 

 

Результат/действие

Обнаружение коричневого пигмента (как меланин):

Можно использовать азур В для того, чтобы отличить меланиновый пигмент и DAB хромогена. Меланин окрашивается сине-зеленым, DAB хромоген остается коричневым.

Можно использовать AEC в качестве хромогена. Если в ткани уровень пигмента высок, красный хромоген может быть частично подавлен. Так как протоколы обесцвечивания меланина могут нарушить антигенную структуру ткани, этой процедуры по возможности, лучше избегать.

 

 

 

 

 

№2

 

 

 

Препарат

 

Ткань положительного контроля:

 

 

 

 

 

 

DAB/AEC+докрашивание

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.

 

 

ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

 

 

 

 

Коричневый/красный цвет:

Свидетельствует об эндогенной пероксидазной активности в ткани. Можно обнаружить во всех тканях, содержащих гемопротеин, в том числе, в эритроцитах, мышцах, печени, почках, гранулоцитах и моноцитах.

Блокируется с помощью 3% раствора перекиси водорода или других реактивов. Используя свежую перекись водорода, приготовьте блокатор эндогенной пероксидазы, трехпроцентный раствор H2O2, затем используйте DAB и докрасьте срез.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 207

Устранение неисправностей

Глава 21

 

 

Реагент

Результат/Действие

 

 

 

 

 

№3

 

Ткань положительного контроля:

 

Препарат

 

 

 

пероксидазный блок+вторичные

 

 

 

 

 

 

антитела+стрептовидин-HRP+DAB/

 

 

 

AEC+докрашивание

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.

 

 

ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

№4

 

Пероксидазный блок+биотиновый

 

Препарат

 

блок (если требуется)+вторичный

 

 

 

 

 

 

антитела+стрептовидин-HRP+DAB/

 

 

 

AEC+ докрашивание

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.

 

 

ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

 

 

 

 

 

 

 

 

№5

 

 

Препарат

Ткань положительного контроля

 

 

 

 

 

 

 

 

НЕТ ОКРАШИВАНИЯ.

ПЕРЕХОД К СЛЕДУЮЩЕМУ ПУНКТУ

Коричневый/красный цвет:

Указывает на эндогенную активность биотина в ткани. Биотин, связанный с белками, можно обнаружить в надпочечниках, печени, почках, ЖКТ, легком, селезенке, мозге, молочной железе, жировой ткани, лимфоидной ткани и культурах клеток, выращенных на биотине (RPMI, NCTC, MEME).

Блокируйте активность эндогенного биотина или поменяйте метод окраски на независящий от реакции биотин/стрептовидин.

Коричневый/красный цвет:

Указывает на неспецифическое или нежелательное связывание вторичных антител с антигенами ткани. Первично возникает, если вторичные антитела не подходят к использованию на специфических образцах ткани (например, биотинизированных антител в богатых биотином тканях).

Для решения этой проблемы абсорбируйте неспецифические антитела, добавлением 2,5 – 10,0 мкл нормальной сыворотки (того же животного, которое окрашивается) на 100 мкл вторичных антител.

Коричневый/красный цвет:

Может свидетельствовать о неспецифическом связывании белков-переносчиков первичных антител. Приготовьте протеиновый блок из нормальной сыворотки животного-донора меченных антител добавьте 0,05-0,1% TWEEN 20 к промывочному буферу чтобы снизить взаимодействие белков.

Может появиться липофусцин – артефакт температурной демаскировки антигенов, пылевидное окрашивание – в печени, тканях сердца, или как специфическое окрашивание срезов поджелудочной железы.

208 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/