- •Тема 2. Иммунологические методы исследований. Понятие об иммунограмме
- •Задания для проверки начального уровня знаний.
- •Источники учебной информации
- •Ориентировочная основа действия
- •Иммунологический анамнез
- •Данные клинического обследования
- •Тесты, которые проводятся на больном (in vivo)
- •Лабораторные исследования Исследование факторов естественной резистентности организма
- •Определение показателей фагоцитоза:
- •Иммунологические тесты, которые характеризуют клеточный иммунитет (т – звено).
- •Иммунологические тесты, которые характеризуют гуморальный иммунитет (в – звено).
- •Методы для выявления антител и антигенов
- •Определение уровня аллерген-специфичних IgE
- •Реакции, основанные на выделении сенсибилизированными лейкоцитами медиаторов, ферментов и других биологически активных веществ под влиянием аллергенов.
- •Определение антител, связанных с лейкоцитами
- •Иммунный статус
- •I. Анализ анамнеза:
- •II. Клиническое обследование:
- •Тесты і уровня:
- •Тесты II уровня:
- •Интерпретация иммунограмм
- •Пример 1. Пациентка л., 22 года. Диагноз: Острый фурункулез.
- •Задания для заключительного контроля знаний.
Определение уровня аллерген-специфичних IgE
Иммуноферментный анализ включает использование антител, меченных ферментом. Сущность ИФА состоит в том, что при добавлении исследуемой сыворотки, содержащей IgE-антитела к аллергену, связанному с полистироловой поверхностью микропланшет, образуется комплекс аллерген-антитело IgE. Количество связавшегося IgE, т. е. антител, определяют с помощью меченных ферментом антител против IgE. Для этого в лунки планшет для анализа вносят анти-IgE-антитела, меченные пероксидазой хрена (или другим ферментом) и сіворотку больного. В результате этого антитела против IgE специфически связываются с IgE, находящимся в комплексе аллерген-антитело IgE или свободніми от антигена (аллергена). В дальнейшем добавляют реагенты (орто-фенилендиамин и перекись водорода) и выявляют активность пероксидазы по цветной реакции, интенсивность которой оценивают на спектрофотометре.
Метод ИФА выявляет только «избыток» IgE, свободных антител в сыворотке крови, но не определяет антитела, связавшиеся с мембранами клеток - базофилами и другими лейкоцитами. Поэтому отрицательный тест не гарантирует отсутствие у больного «вооруженных» IgE базофилов и развитие аллергической реакции. Положительный тест на специфические IgE указывает на аллергию.
Нефелометрический метод микропреципитации по Уанье применяют для обнаружения IgG-, IgM-антител к гаптенам (лекарствам) в сыворотке крови. Готовят двухкратные разведения аллергена и сыворотки крови больного. В одну кювету фотоэлектроколориметра (ФЭК) вносят 1,5—1,8 мл исследуемой сыворотки крови (исходное разведение 1:2), в другую — контрольный раствор или сыворотку крови здорового человека. Измеряют исходную оптическую плотность на спектрофотометре (светофильтр №4, при длине волны.= 500 нм). Затем в каждую кювету добавляют по 0,1 мл разведенного аллергена, начиная с минимальной концентрации, и перемешивают. Через 2 мин снова определяют оптическую плотность смеси в кюветах. Реакцию проводят сначала с разными разведениями аллергена, затем, когда определена его минимальная концентрация - с сывороткой (для определения ее титра). Оптимальная концентрация гаптена - это та, которая вызывает задержку снижения или даже увеличение оптической плотности смеси. Реакция обусловлена образованием иммунніх комплексов антиген+антитело в растворе. При испытании лекарств ориентировочной концентрацией является суточная доза, растворенная в 1 л дистиллированной воды.
Реакция считается положительной, если оптическая плотность смеси сыворотка + аллерген при добавлении определенных его концентраций (как при отрицательном результате) не снижается или даже увеличивается.
Непрямой метод выброса ионов калия из лейкоцитов используется для выявления антител в сыворотке крови. Лейкоциты здорового человека обрабатывают сывороткой больного с аллергией, и если в ней были антитела, то они связываются с лейкоцитами. Добавленный аллерген связывался с антителами и вызывал выброс калия в реакционную среду. Концентрацию ионов калия определяют на пламенном фотометре.
Сравнивают концентрацию ионов калия в контрольных и опытных пробах. Превышение калия в опыте меньше чем на 15% по сравнению с контролями — реакция отрицательная. Увеличение концентрации калия в опыте более чем на 20% по сравнению с контролем указывает на сенсибилизацию к лекарственному препарату, от 15 до 20% — реакция сомнительная.
Реакция повреждения нейтрофилов основывается на нарушенных лейкоцитов под воздействием аллергена. С помощью этой реакции возможно оценить гиперчувствительность немедленного типа. Наиболее целесообразно применение этой методики для выявления сенсибилизации к медикаментам. Позитивная реакция (наличие гиперчувствительности) считается тогда, когда количество лейкоцитов уменьшились на 20-30 %.