Бактериологическое исследование

1 день

материал Цель исследования - накопление микроорганизмов.

1 .Визуальный контроль 2.Ориентировочная микроскопия

2. день

рост на средах Мюллера, Кауфмана

2. день

рост изолированных колоний на среде Эндо

2. день

рост чистой культу­ры

3.Посев на среды накопления Мюллера. Кауфмана (в термостат на 24 часа при +37°С)

Цель исследования - получение изолированных колоний.

1 .Визуальный контроль

2. Микроскопия

3. Посев на среду Эндо (+37°С, 24 часа)

Цель - получение чистой культуры.

1 .Визуальный контроль

2.Микроскопия (изучение морфологии, тинкториальных свойств)

3. Реакция агглютинации с О и Н монорецепторными сальмонел- лезными сыворотками

4. Посев на скошенный агар (МЦА) +37°С, 24 часа

Цель - идентификация микробного вида.

1 .Визуальный контроль

2. Микроскопия (1, 2 делают для того, чтобы убедиться в чистоте культуры)

3. Изучение биохимических свойств

4. Пробы Штерна, Биттера

5. Серологическая идентификация с набором диагностических агг­лютинирующих сывороток (к S.cliderae bius, C.enterilidis, S.typbrimurium).

Приложение № 3

Методы дополнительного тестирования и диагностики

Среды накопления:

1. Среда Мюллера (МПБ + мел + раствор Люголя + гипосульфит).

2. Среда Кауфмана (ср. Мюллера + желчь + 0,1 % водный раствор бриллиантового зеле­ного).

Диагностическо-дифференциальные пробы:

Проба Штерна: Глицериновый фуксин - бульон по Штерну составлен по принципу среды Эндо (МПБ + 5 капель спиртового раствора основного фукси­на + сульфит натрия + глицерин). Среда золотисто-желтая. В среде Штерна па­лочка Бреслау с первого дня образует интенсивное лилово-красное окрашива ние (ранняя реакция), палочка Гертнера - с 3-5 дня, бактерии паратифа В по­добные изменения вызывают на 6-9 день (поздняя реакция). Изменение цвета идет за счет восстановления фуксина, ранее обесцвеченного сульфита натрия. Восстановление — за счет образования кислоты или альдегидобразования.

2. Проба Биттера: Среда Биттера с рамнозой (дистиллированная вода + двуос­новной фосфорнокислый натрий + сернокислый аммоний + лимоннокислый натрий + хлористый натрий + пептон + рамноза).

К суточной культуре, выросшей на этой среде, добавляют 2-3 капли 0,5 % спиртового раствора метилрота. В зависимости от степени, кислотоустойчиво- сти среда краснеет или остается желтой. Бреславская палочка дает красную ок­раску, суипестифер - оранжевую или желтую, паратифа В - желтую.

Серологическая диагностика

Постановка реакции Видаля с сывороткой больного. Она имеет основное диагно­стическое значение у детей раннего возраста, т.к. процент положительных гемо- копро- культур у них невысок. Дагностический титр взрослых 1 : 200, у детей - 1 : 100. Диагно­стическое значение имеет повышение титра антител при повторном исследовании.

Приложение № 4

Схема исследования на токсичность стафилококка по Г.Н Чистовичу (1969)

Материал исследования

ЖСА - желточно-солевой агар Г.Н. Чистовича элективен для стафилококков в свя­зи с высоким содержанием хлористого натрия (10 %), а добавленный яичный желток (1 на 100 мл МПА) позволяет выявлять лецитовителлазную активность, которая является одним из показателей патогенности стафилококков. Поэтому ЖСА более четко дифференцирует патогенных представителей, чем кровяной агар.

Реакция плазмоагглютинации:

Микробную массу размешать петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1 : 4. Образование хлопьев учитывают в течение 30 сек-1 мин. При наличии плазмоагглютинации штаммы считают патогенными.

Коагулазная проба развернутая

Ассептично взятую кровь обрабатывают 1 -4 % раствором цитрата или 0,1 % оксалата, для получения плазмы кровь центрифугируют или отстаивают на холоду, отсасыва­ют пипеткой. Плазму по 0,2-0,3 мл наливают в стерильные пробирки + 1 петля или 0,1 мл испытуемой бульонной культуры. Контроль - то же с заведомо патогенным стафилококком. Все пробирки выдерживают в термостате при +37°С. Учет проводят дважды: через 2- 3 часа и 24 часа по свертыванию плазмы и образованию сгустков. Активные культуры дают положительную реакцию уже через 2-3 часа, слабокоагулирующие - в более поздние сроки.

Определение фибролизина методом Кристи:

Среда Кристи-Чемпена; мясной экстракт, пептон, хлористый натрий, агар, вода, рН=7,0. Стерилизуют в автоклаве, хранят впрок.

Перед опытом растапливают агар, остужают до +50оС, добавляют 20% стерильной плазмы. Прогревают в водяной бане при +70оС в течение 2-5 минут до появления явной мути, разливают в чашки Петри. Испытуемые культуры засевают «пятнами» по 15-20 на чашку. Посевы инкубируют при +37оС. Учет результатов по зонам просветления (лизиса фибрина) вокруг колоний ведут через 14, 24, 48 часов.

Для изучения токсигенности стафилококков используют:

Метод Илека и Леви (1950)

Берут чашки с МПА + 5 % отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана (кролика, человека). На поверхность питательной среды по диаметру помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой. Отступив 1-2 мл от края полоски перпендикулярно к ней засевают штрихами исследуемые культуры. Посевы инкубируют при +37оС в течение суток, после чего учитывают результаты;

альфа-гемолизин проявляется в виде полного просветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой мазка полоски. Он выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами;

бета-гемолизин на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление, зона ко­торого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это «тепло-холодовой» токсин и лучше выяв­ляется после дополнительного суточного выдерживания чашек в холодильнике при +4оС по характерному послойному гемолизу бараньих эритроцитов и не нейтрализуется альфа- антитоксической сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен;

дельта-гемолизин определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой.

Приложение № 5