Аудиторная работа

Лабораторная работа (количественное определение

пировиноградной кислоты – видоизмененный метод Умбрайта).

Содержание пировиноградной кислоты /ПК/ в крови и тканях может изменяться при некоторых патологических состояниях – кислородной недостаточности, дефиците витамина В₁ и других.

Определение ПК в крови основано на том, что она при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразином образует 2,4-динитрофеназол - соединение желтого цвета. При добавлении спиртового раствора щелочи к толуоловому экстракту, содержащему это соединение, развивается оранжево-красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию ПК. Определяя оптическую плотность раствора, можно рассчитать содержание ПК с помощью калибровочного графика.

Ход работы. 1. Приготовить безбелковый фильтрат крови: в пробирку внести 2 мл 10% раствора трихлоуксусной кислоты и затем 0.4 мл крови, смешать и после 10-минутной экспозиции фильтровать через бумажный фильтр. 2. В сухую пробирку внести 1 мл фильтрата, добавить 0.5 мл 0.1% раствора солянокислого раствора 2,4-динитрофенилгидразина и через 5 мин прилить 2.5 мл водонасыщенного толуола. Энергично встряхивать 2 мин и оставить до расслоения. Из толуолового (верхнего) слоя отобрать 1 мл и перенести в сухую пробирку. Прилить 2 мл спиртового раствора щелочи.

Одновременно проводится контрольная проба – в неё вместо фильтрата крови вносится дистиллированная вода.

Оптическую плотность полученного в опыте раствора колориметрировать против контрольной пробы (кювета 5 мм, фильтр синий). По результатам определения оптической плотности устанавливают содержание ПК, учитывая, что 1 мл крови соответствует 0.2 мл безбелкового фильтрата.

Для построения калибровочной кривой вносят в последовательно пронумерованные пробирки 0.2, 0.4, 0.6, 0,8 и 1.0 мл стандартного раствора ПК, доводят каждую пробирку водой до 1 мл и проводят те же операции, что в опыте. При построении кривой откладывают на оси абсцисс количества ПК в исследуемом ряду пробирок, а на оси ординат найденные значения оптической плотности.

Привести аргументированные ответы на следующие вопросы или выполнить указанные действия:

1. Энерготраты обследуемого пациента составляют 35000 ккал/сут. Липидами и белками рациона обеспечено 40% энерготрат.

Рассчитать потребность в углеводах:

а) при их полном усвоении,

б) при усвоении 75% углеводов пищевого рациона.

2. Молочная кислота в защищенной от доступа кислорода биологической системе образуется со скоростью 0.1 мкмоля/ч. Единственный субстрат окисления – глюкоза.

Рассчитать расход глюкозы.

3. Превращение НАД.Н+ → НАД в гликозилирующей системе протекает со скоростью 0.1 мкмоля/ч. Единственный субстрат окисления – глюкоза.

Сколько молей глюкозы потребляет система за 1 ч?

4. Подсчитать энергетический эффект гликолиза: субстрат – гликоген, скорость образования лактата – 0.05 мкмолей в час на 1 г ткани.

5. Рассчитать энергетический эффект гликолиза, если заблокирована реакция изомеризации на этапе превращений фосфодиоксиацетона в 3-фос­фо­глицериновый альдегид (исходите из допущения, что фосфодиоксиацетон не влияет на скорость процессов).

ЗАНЯТИЕ 11 (количественное определение углеводов).

Цель: изучить основной (прямой) и пентозофосфатный пути превращения углеводов, ознакомиться с процессом глюконеогенеза.

Студент должен знать:

1. Какое соединение обеспечивает перенос Н-ионов, используемых для восстановления пировиноградной кислоты /ПК/ в молочную.

2. Что происходит с восстановленной формой НАД (НАД.Н+) если в систему окисления имеется доступ кислорода (т.е. ПК не восстанавливается).

3. Что представляет собой окислительное декарбоксилирование.

4. Какие соединения участвуют в окислительном декарбоксилировании ПК, роль каждого из них (пантотеновая кислота, тиамин, липоевая кислота).

5. Что все α-кетокислоты в тканях подвергаются декарбоксилированию по такому же механизму, как и ПК.

6. Какой продукт образуется при окислительном декарбоксилировании ПК, его особенность и возможные пути превращений.

7. Какой продукт появляется при конденсации ацетил-КоА со щавелевоуксусной кислотой /ЩУК/, последующие превращения этого продукта.

8. Почему всю совокупность этих превращений называют циклическими, а процесс в целом имеет несколько наименований.

9. Путь протонов, которые отдают метаболиты цикла Кребса, почему в одних случаях транспорт пары протонов сопровождается синтезом 2-х, а других случаях – 3-х молей АТФ.

10. Объяснить энергетический эффект цикла Кребса.

11. Субстрат пентозофосфатного пути превращения углеводов /ПФП/.

12. Ветви ПФП, важнейшие продукты окислительной и неокислительной ветвей.

13. Лимитирующие ферменты неокислительной ветви ПФП, витамин, участвующий в образовании кофермента, его коферментную форму.

14. В каких процессах участвуют продукты обеих ветвей ПФП.

15. Значение и химизм глюконеогенеза, его субстраты и их предшественники.

16. Роль фосфатазы в глюконеогенезе.

.Студент должен уметь:

1. Схематически изобразить основной и альтернативные пути превращения глюкозы в клетке, их взаимосвязь.

2. Схематически показать биологическое значение ПФП (связь окислительной и неокислительной ветвей с синтезом нуклеиновых кислот, липидов, стероидных гормонов).

3. Объяснить, каким образом дефицит кислорода в тканях приводит к гиперлактатемии.

Студент должен получить представление:

1. О возможностях регуляции внешними воздействиями нормального соотношения между анаэробным и аэробным окислением в организме

2. О значении регулярных физических упражнений в переносимости кислородного голодания.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1. О структуре моносахаридов, имеющих пищевое значение

2. О стереоизомерии сахаров.

3. О редуцирующей способности сахаров.

.