Підготувати реферативне повідомлення за темою:
1.Ензимопатологія.
2.Ензимодіагностика захворювань міокарда, печінки.
3.Ензимотерапія.
Алгоритм лабораторної роботи. Кількісне визначення активності АсАТ і АлАТ в сироватці крові.
Принцип методу: визначається оптична густина розчину гідразону кетоглутарату та пірувату, які утворюються при взаємодії аланіну (або аспартату) з кетоглутаратом.
Визначення проводять в 1 см кюветі при довжині хвилі λ – 500-530 нм. При визначенні АсАТ – піруват утворюється шляхом декарбоксилювання оксалоацетата.
Реактиви:
1.Еталонний 2 мМ розчин пірувату.
2.1 мМ розчин 2,4-дінітрофенілгідразіну в 1 М НCl.
3.Розчин NаОН (16 ч. в 1000 мл Н2О).
4.Субстрат АсАТ: а) 0,1 мМ розчин аспартату;
б) 0,2 мМ розчин кетоглутарату;
в) фосфатний буфер рН-7,4.
5. Субстрат АлАТ: а) 0,2 мМ розчин аланіну;
б) 0,2 мМ розчин кетоглутарату; в) фосфатний буфер рН-7,4.
Визначення активності АсАТ.
Реактиви, послідовність дії |
Дослідна проба |
Контроль |
Реактив 4 |
0,25 мл |
0,25 мл |
Фізіологічний розчин |
--- |
0,05 мл |
Сироватка крові |
0,05 мл |
--- |
Інкубація до 60 хв. При t |
|
|
= 23 о |
+ |
+ |
Реактив 2 |
0,25 мл |
0,25 мл |
Перемішуємо і залишає- |
|
|
мо на 20 хв. при t = 23 о |
+ |
+ |
Розчин лугу |
2,5 мл |
2,5 мл |
Перемішуємо і через 10 хв. визначаємо оптичну густину дослідної проби проти
контролю в кюветі 1см при довжині хвилі λ – 500-530 нм.
Визначення активності АлАТ проводять по тій же схемі, але замість реактиву 4,
беруть реактив 5.
Для розрахунку активності будують калібровачний графік з розчинами 1 і 2. В сироватці крові здорової людини активність:
АсАТ = 0,1 – 0,45 мМ / г / л АлАТ = 0,1 – 0,68 мМ / г / л
ТЕМА 7. ДОСЛІДЖЕННЯ РОЛІ КОФАКТОРІВ ТА КОФЕРМЕНТНИХ ВІТАМІНІВ У КАТАЛІТИЧНІЙ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ.
Актуальність теми.
Ферменти як каталізатори приймають участь в усіх без виключення біохімічних
процесах, які лежать в основі життєдіяльності живої матерії. Коферменти входять до складу більшості ферментів і практично визначають активність останніх.
Коферментні (активні) форми водорозчинних вітамінів беруть участь в регуляції
життєво важливих біологічних процесів, а також знаходять широке застосування в клінічній практиці для корекції порушень процесів метаболізму.
Мета та вихiдний piвень знань.
Загальна мета: вміти трактувати біохімічні закономірності функціонування вітамінів (та їх коферментних форм) як компонентів харчування людини та регуляторів
ферментативних реакцій і обмінних процесів. Вміти чітко дослідити взаємозв’язок па-
18
тогенезу розладів при різних гіповітамінозах с функціонуванням певних ланок обміну речовин.
Конкpетна цілі: мати чітку уяву о біологічних функціях водорозчинних кофермент-
них вітамінів В2, РР, В6. Вміти писати формули найбільш важливих коферментів, та розуміти принципи та мету визначення в біологічних рідинах їх попередників.
Вихiдний piвень знань-вмiнь. Інтерпретувати механізми участі вітамінів в побудові |
|
коферментів, що каталізують біохімічні реакції в організмі (на прикладі НАД+). |
|
Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами |
|
навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття. |
|
Зміст і послідовність дій |
Вказівки до навчальних дій |
1.Практичне вивчення якісних 1.1. В зошит протоколів практичних занять ви-
реакцій на вітаміни В2, РР, В6. писати алгоритм лабораторної роботи.
2.Небілкова частина складних 2.1. Визначення поняття “коферменти”. Водо-
ферментів. |
розчинні вітаміни як попередники в біосинтезі |
|
коферментів. |
|
2.2. Визначення поняття “кофактори”, їх вплив |
|
на структуру та каталітичну активність ферме- |
|
нтів. |
3. Коферменти. |
3.1. Будова і властивості коферментів. |
|
3.2. Класифікація коферментів за хімічною |
|
природою. |
|
3.3. Класифікація коферментів за типом реак- |
|
ції, яка каталізується: |
|
а) коферменти, що є переносниками атомів |
|
водню та електронів; |
|
б) коферменти, що є переносниками хімічних |
|
груп; |
|
в) коферменти синтезу, ізомеризації та розще- |
|
плення вуглець-вуглецевих зв’язків. |
4. Характеристика та властивості 4.1. Участь коферментних форм вітамінів В2 та |
|
коферментних форм вітамінів В2, |
РР в окисно-відновних реакціях. |
РР, В6. |
4.2. Вплив коферментних похідних вітамінів В6 |
|
на окремі ланки метаболізму. |
Індивідуальна самостійна робота студентів.
1.Створення схеми в електронному варіанті до теми “Коферментні вітаміни”.
2.Написання структурних формул коферментних вітамінів та пояснювання механізму
утворення їх біологічно активних (коферментних) форм.
Алгоритм лабораторної роботи.
1) Якiсна pеакцiя на вiтамiн B2 .
Пpинцип методу: pеакцiя на вiтамiн B2 базується на його здатностi легко
вiдновлюватися, пpи цьому pозчин B2 жовтого кольоpу, набуває спочатку pожевого
кольоpу, а потiм знебаpвлюється, так як утворюється вiдновлена фоpма B2.
Хiд pоботи: до 10 крап. вiтамiну B2 додають 5 крап. HCl та залiзну стpужку. Спостеpiгають видiлення пузиpiв водню. Розчин поступово забаpвлюється в pожевий
колip, а потiм знебаpлюється.
2) Якiсна pеакцiя на вiтамiн B6 .
Пpинцип методу: вiтамiн B6 пpи взаємодiї з pозчином хлоpного залiза утвоpює комплексну сiль типу феноляту залiза чеpвоного кольоpу.
Хiд pоботи: до 5 крап. вiтамiну B6 додають 5 крап. 1% pозчину хлоpного залiза. Утвоpюється комплекс чеpвоного кольоpу.
19