Научные стремления 2011-1

Проведенные исследования показали, что наиболее тонкие и однородные элементарные волокна со средним диаметром от 11 до 21 мкм получены у образцов № 1 и 10. Анализ микрофотографий волокон выявил наличие инкрустации микрофибрилл у всех образцов, что обусловлено присутствием нецеллюлозных полисахаридов и пектина. Однако наиболее тонкие и однородные элементарные волокна со средним диаметром от 11 до 21 мкм получены у образцов № 1 и 10. Таким образом, показана взаимосвязь структурно-морфологических показателей строения стебля у исследуемых генотипов с одной стороны и содержанием и качеством волокна с другой стороны.

Рисунок 1 – Ультраструктуры и морфологические показатели волокна растенийтрансформантов образцов № 1, 4

Выводы. Использование метода динамической термогравиметрии при изучении образцов растений-трансформантов льна-долгунца позволило с высокой точностью идентифицировать основные полимерные компоненты клеточной стенки льна: целлюлозу, лигнин, воду и зольные элементы. Получаемая в результате проведения термогравиметрического анализа кривая зависимости изменения массы от температуры и величина энергии активации термической деструкции образцов позволила оценить качество исследуемого льноволокна. Установлена взаимосвязь между структурно-функциональными параметрами элементарных волокон, полученными методом сканирующей электронной микроскопии, и результатами, полученными с помощью динамической термогравиметрии. Методы термогравиметрии и электронной микроскопии могут быть использованы для выявления технологических критериев оценки качества волокна растений-трансформантов.

Среди исследуемых образцов выделены растения-трансформанты № 1, 6 и 10, характеризующиеся высоким содержанием и качеством целлюлозы, кроме того, образцы № 1 и 10 имеют тонкие и однородные элементарные волокна. Данные образцы планируется вовлечь в селекционный процесс для закладки нового поколения конкурентоспособных сортов льна.

Литературные источники

1. Термический анализ и сканирующая электронная микроскопия с электроннозондовым анализом в комплексных исследованиях структуры биологических объектов /

191

В.Н. Леонтьев [и др.] // Материалы, технологии, инструменты. – 2005. – Т. 10, № 4. – С. 109115.

2.Шаптуренко, М.Н. Межсортовой полиморфизм льна-долгунца (Linum usitatissimum l.) различного эколого-географического происхождения / М.Н. Шаптуренко, С.В. Кубрак // Весці НАН Беларусі. Сер. біял.навук. – 2011. № 1. С. 33-36.

3.Van der Oever, M.J.A. Improved method for fiber content and quality analysis and their application to flax genetic investigations / M.J.A. Van der Oever, N. Bas, L.J.M. van Soest // Industrial crop and products. – 2003. – V. 18. – P. 231-243.

S.V. Kubrak 1, E.A. Flyurik 2, E.V. Feskova 2

THE USE OF PHYSICAL AND CHEMICAL METHODS FOR THE IDENTIFICATION OF THE GENETICALLY RELATED FORMS OF FLAX

1Institute of Genetics and Cytology, National Academy of Sciences, Minsk

2Belarusian State Technological University, Minsk

Summary

The method of the dynamic thermogravimetry has allowed to identify with high precision the basic polymer components of the cell wall of flax: cellulose, lignin, water and ash elements. Thereby this method allows to evaluate the quality of researched flax fiber. The relationship between the structural and functional parameters of the fibers obtained by scanning electron microscopy, and the results obtained by dynamic thermogravimetry was established.

Methods of thermogravimetry and electron microscopy can be used to identify the technological criteria of fiber quality of plant transformants.

192

УДК 577.1

А.И. Кравцова, А.Э. Салем

ВЛИЯНИЕ АЛКАЛОФИЛЬНОЙ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ НА СТАБИЛЬНОСТЬ

НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА

Белорусский Государственный университет, биологический факультет, кафедра биохимии, лаборатория обмена веществ, Минск

В последнее десятилетие наблюдается интенсивное использование наночастиц в медицине. В связи с этим очень важно понять, каким образом происходит взаимодействие между наноматериалами и белками. В биологических жидкостях белки могут адсорбироваться или связываться с наночастицами. Такого рода адсорбция может иметь значительное влияние на биологическом, клеточном и биохимическом уровнях [1, 2, 3].

Bacillus circulans var. алкалофильная АспАТ была экспрессирована в E.coli и очищена на DEAE-Сефарозе с последующей гель-фильтрацией на Сефадексе G-100.

Адсорбция белков на модифицированных наночастицах – это адсорбция, основанная на электростатическом взаимодействии (в эксперименте были использованы наночастицы с гидродинамическим радиусом 18 нм; цитратмодифицированные наночастицы и АспАТ находились в одинаковых условиях эксперимента). Взаимодействие наночастиц с белком исследовалось методом спектроскопии поглощения в УФ- и видимой области. Наночастицы золота имели максимум поглощения при длине волны 524 нм, что согласуется с данными других авторов. Наночастицы коллоидного золота заряжены отрицательно, рекомбинантная аспартатаминотрансфераза адсорбируется на их поверхности только в случае, когда рН среды меньше значения ее изоэлектрической точки. В данной работе мы изучали влияние рекомбинантной аспартатаминотрансферазы на стабильность цитратмодифицированных наночастиц при разных значениях рН. Нами было обнаружено, что при кислых значениях рН наночастицы золота не стабильны. Инкубация наночастиц в этих условиях без АспАТ приводила к сильному смещению спектра с максимумом поглощения в области 670 нм. В то же время наблюдалось падение оптической плотности в области 524 нм, что свидетельствовало об агрегации наночастиц. Однако при добавлении АспАТ (предварительно отдиализированной цитратфосфатным буфером с подходящим значением рН) в среду с наночастицами они сохраняли стабильность, максимум поглощения возвращался к значению, близкому 524 нм, и агрегация наночастиц предотвращалась (рисунки 1, 2, 3).

Рисисунок 1 - Инкубация наночастиц золота в кислых условиях (рН=3) без АспАТ ведет к сильному смещению спектра с максимумом поглощения при 670 нм; одновременно происходит падение оптической плотности при 524 нм, тогда как в присутствии АспАТ максимум поглощения близок к 524 нм.

193

Рисунок 2 - Влияние адсорбции рекомбинантной АспАТ на стабильность наночастиц золота в 12.5 мМ цитрат-фосфатном буфере, рН 4.10

Рисунок 3 - Влияние рекомбинантной АспАТ на стабильность наночастиц золота в 12.5 мМ цитрат-фосфатном буфере, рН 6.6

Результаты. Нами было установлено, что при значении рН, меньшем, чем значение изоэлектрической точки рекомбинантной АспАТ наночастицы золота стабильны вследствие адсорбции белка на поверхности цитратмодифицированных наночастиц, в то время как при кислых значениях рН наночастицы агрегируют, а красный цвет коллоидных частиц меняется на фиолетовый.

Выводы. Таким образом, оптимальными условиями для образования комплекса между наночастицами золота и АспАТ являются:

Концентрация цитратного буфера меньше 12.5 мМ.

Значение рН буферного раствора меньше значения изоэлектрической точки АспАТ.

Время, необходимое для образования комплекса, не должно превышать 40 мин., иначе будет происходить агрегация наночастиц.

Литературные источники

1. Tanigaki, K.; Ebbesen, T.W.; Saito, S.; Mizuki, J.; Tsai, J. S.; Kubo, Y.; Kuroshima, S. Nature 1991, 352, 222.

194

2.Characterising the potential risks posed by engineered nanoparticles: a first UK government research report. Edited by Department for Environment FaRA; 2005.

3.Ryman-Rasmussen JP, Riviere JE, Monteiro-Riviere NA:nVariables influencing interactions of untargeted quantum dot nanoparticles with skin cells and identification of biochemical modulators. Nano Lett 2007, 7:1344-1348.

A.I. Kravtsova, A.E. Salem

THE INFLUENCE OF ALKALOPHILIC ASPARTATE AMINOTRANSFERASE ON STABILITY OF GOLD NANOPARTICLES

Belorusian State University, faculty of Biology, department of Biochemistry, laboratory of metabolism, Minsk

Summary

We have found that at pH less than the pH of isoelectric point of recombinant Aspartate aminotransferase, the Gold colloid nanoparticles is stable because of adsorption of protein on the surface of citrate modified Gold nanoparticles, but at acidic pH the citrate modified nanoparticles is aggregated and the color of the colloid is changed from red to violet.

195

УДК 661.722.098.4

И.Н. Кузнецов, Н.С. Ручай, А.И. Лембович, М.А. Сазановец

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД В ТЕХНОЛОГИИ ПЕРЕРАБОТКИ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ

Белорусский государственный технологический университет, Минск

Послеспиртовая барда является крупнотоннажным обременительным отходом производства этанола из крахмалсодержащего сырья, переработка которого необходима для предотвращения неблагоприятного воздействия отхода на окружающую среду и повышения степени использования компонентов продовольственного сырья.

Несмотря на разнообразие используемых в мировой практике технологических процессов переработки послеспиртовой барды [1], остается актуальной проблема создания рациональной технологии, обеспечивающей максимальное использование сухих веществ барды для получения ценных продуктов.

В настоящее время наибольший интерес представляют технологии переработки барды с получением белоксодержащей кормовой добавки и биогаза. На мировом рынке широко представлен кормовой продукт в виде сухой барды, однако он обладает невысокими потребительскими свойствами: содержит трудно перевариваемые углеводы (клетчатку) при низкой доле истинного протеина. В настоящей работе поставлена задача создания технологи комплексной переработки послеспиртовой барды с получением обогащенного белком кормового продукта.

Предлагаемая технология разработана по результатам выполненных исследований [2, 3] и основывается на следующих экспериментально подтвержденных технологических решениях:

-ферментативная обработка барды с целью расщепления полисахаридов (прежде всего клетчатки);

-целенаправленное культивирование термотолерантных (42 0С) факультативно анаэробных микроорганизмов-продуцентов белка на ферментативно обработанной барде;

-анаэробная переработка барды с разделением процесса на две стадии,

реализуемые в отдельных аппаратах: преацидификация подготовленной барды при температуре 42 0С и анаэробное сбраживание (метангенерация) фугата преацидифицированной барды с биотрансформацией растворенных веществ в биогаз;

-совмещение процесса преацидификации барды с ферментативной обработкой и целенаправленным культивированием продуцента белка с последующим отделением обогащенных протеином взвешенных веществ центрифугированием для получения белоксодержащего кормового продукта;

-очистка сброженного фугата барды ультрафильтрацией.

Сухие вещества барды на 56% представлены взвешенными веществами, содержащими главным образом протеин и клетчатку, присутствие которых

196

замедляет процесс анаэробного разложения органических компонентов барды [2], Ускорить этот процесс возможно преацидификацией, которая заключается в выдержке барды в течение нескольких суток для обеспечения спонтанного развития кислотогенных микроорганизмов, осуществляющих гидролитическое расщепление биополимеров. В процессе преацидификации барды при 50 ºС в течение 5 суток содержание клетчатки снижается на 12-13%. Значительная часть клетчатки в сброженной барде остается нерасщепленной, а значит неиспользованной.

Для расщепления полисахаридных компонентов барды использовали ферментный препарат «Rovabio Excel AP». При длительности процесса ферментативной обработки 24 ч концентрация редуцирующих веществ в барде возрастает с 0,25 до 1,5 %, что составляет 50 % от потенциального количества редуцирующих веществ из полисахаридов послеспиртовой барды.

Ферментный препарат осуществляет перевод части взвешенных веществ барды в растворенное состояние. Показатель ХПК жидкой части барды после ферментативной обработки возрастает с 30 000 мг О2/л до 45 000 мг О2/л, а содержание клетчатки в сухом веществе барды снижается на 40%.

Стадию преацидификации барды целесообразно совместить с ферментативной обработкой и целенаправленным культивированием термотолерантных микроорганизмов – продуцентов белка, накопленная биомасса которых повысит качество кормового продукта, получаемого на основе взвешенных веществ барды.

Из микробиоты, естественно развивающейся в послеспиртовой барде в процессе преацидификации при 42 С, выделен штамм, активно накапливающий биомассу в условиях отсутствия аэрации. Идентифицированный штамм отнесен [4, 5] к непатогенным дрожжам рода Lachancea, имеет удельную скорость роста 0,12 ч-1, активно развивается при температуре 40-42 ºС, накапливает до 0,51 г/л биомассы по аб. с. в. на фугате ферментированной барды и может быть использован в качестве продуцента белка на стадии преацидификации ферментированной барды.

Получен опытный образец сухого кормового продукта в результате культивирования выделенного штамма дрожжей на ферментированной барде в процессе ее преацидификации с последующим отделением взвешенных веществ центрифугированием. Качественные показатели продукта, представленные в таблице, свидетельствуют о его более высоких потребительских свойствах в сравнении с сухой бардой.

Освобождение преацидифицированной барды от взвешенных веществ обеспечивает возможность анаэробного сбраживания фугата с получением биогаза в высокопроизводительном UASB-реакторе. При моделировании непрерывного процесса сбраживания фугата барды в лабораторном UASBреакторе лучшие показатели достигнуты при времени удерживания фугата в биореакторе 17 суток: выход биогаза 14,6 м3/м3, степень трансформации сухих веществ фугата 74,7% или 88,5% по показателю ХПК. Установлена возможность ультрафильтрационной очистки сброженного и осветленного

197

отстаиванием фугата до уровня загрязненности по ХПК 600-1000 мг/л, что позволяет осуществить сброс его на городские очистные сооружения.

Таблица 1 - Качественные показатели опытного образца белоксодержащего кормового продукта

1 – приемник барды; 2 – преацидификатор; 3 – декантерная центрифуга; 4 – сборник кека; 5 – шнек-смеситель; 6 – роторно-дисковая сушилка; 7 сборник фугата; 8 – UASBреактор; 9 – сухой газгольдер; 10 – факельная установка; 11 – адсорбер для удаление H2S; 12 – отстойник; 13 – ультрафильтрационный модуль; 14 – сборник осветленного сброженного фугата; 15 – спиральный теплообменник

Рисунок 1 - Технологическая схема процесса комплексной переработки послеспиртовой барды

Технология комплексной переработки послеспиртовой барды (рисунок 1) включает следующие технологические стадии: преацидификация барды в присутствии гидролитических ферментов, расщепляющих полисахаридные компоненты, с одновременным культивированием факультативно-анаэробного термотолерантого штамма-продуцента белка; разделение фаз барды

198

центрифугированием с получением кека и фугата; сушка кека в роторнодисковой сушилке с получением кормового белоксодержащего продукта; анаэробное сбраживание фугата барды в UASB-реакторе с получением биогаза; доочистка осветленного сброженного фугата ультрафильтрацией; адсорбционная очистка биогаза от сероводорода.

Разработанная технология позволяет получить из 1 т послеспиртовой барды 50-55 кг сухого белоксодержащего кормового продукта и 13-14 м3 биогаза.

Литературные источники

1.Кузнецов И.Н., Ручай Н.С. Анализ мирового опыта в технологии переработки послеспиртовой барды // Труды БГТУ. Сер. 4, Химия, технология органических веществ и биотехнология. – 2010 – Вып. 18. – с.294-301.

2.Кузнецов И.Н, Ручай Н.С., Лембович А.И., Сазановец М.А. Изменение состава послеспиртовой барды при анаэробной и ферментативной обработке // Труды БГТУ. Сер. 4, Химия, технология органических веществ и биотехнология. – 2011 – Вып.19. – с. 298-303

3.Кузнецов И.Н., Ручай Н.С., Лембович А.И. Исследование процесса анаэробной переработки послеспиртовой барды. // Материалы, технологии, инструменты. Т. 16. – 2011 – №2.

–с. 85-89

4.Fungal Databases Nomenclature and Species Banks Online Taxonomic Novelties Submission– Mode of access:http://www.mycobank.org/

5.Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей/М.: Пищевая промышленность, 1979. - 120 с.

I.N. Kuznetsov, N.S. Ruchai, A.I. Lembovich, M.A. Sazanovets

THE COPLEX APPROACH IN STILLAGE PROCESSING

Belorussian State Technological University, Minsk

Summary

The technology of complex processing of stillage with feed additive and biogas production was developed. The technology includes preacidification of stillage with using hydrolytic enzymes which splitting polysaccharides with cultivation of termotolerant strain of yeastsproduceк of protein; receiving dry protein-including feed additive from solids of stillage and biomass of yeasts. Thin stillage goes to UASB-bioreactor with biogas production. Fermented thin stillage after UASBreactor treated by ultrafiltration. 50-55 kg of feed additive, 13-14 m3 of biogas is produced from 1 ton of stillage.

199

УДК 579.222+579.151

A.A. Kastsianevich, L.I. Sapunova

BETA-GALACTOSIDASES OF ARTHROBACTER BACTERIA: MULTIPLE FORMS OR ISOENZYMES?

Institute of Microbiology, Belarus National Academy of Sciences, Minsk

Beta-galactosidase (EC 3.2.1.23) catalyzes not only hydrolysis of terminal nonreducing β-D-galactose residues in β-D-galactopyranosides, including the disaccharide lactose (1,4-O-β-D-galactopyranosyl-D-glucose), but also transgalactosylation reaction that produces galactooligosaccharides of different polymerization degree. Therefore in biotechnology beta-galactosidases are mainly employed for hydrolysis of lactose to D-glucose and D-galactose in various milk products, making it available to a large number of adults and children that are lactose intolerant. Also the enzyme is used for prevention of lactose crystallization in frozen and condensed milk products, for the reduction of water pollution caused by whey and for production of galactooligosaccharides recognized as a growth-stimulating factor for intestinal bifidobacteria and promoting human and animal health [1-3]. It was found recently that beta-galactosidase could be used for lactulose production in vitro [4].

Beta-galactosidase is presented in a wide variety of plants, animals, and microorganisms, including bacteria of genera Alicyclobacillus, Bacillus, Beijerinckia, Bifidobacterium, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Geobacillus, Lactobacillus, Paenibacillus, Pediococcus, Propionibacterium, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Pyrococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Thermoanaerobacter, Thermus, Vibrio, Xanthomonas etc. [5-7]. Although beta-galactosidases from prokaryotes have been well-studied, very few data have been reported on the multiple forms of its enzymes or isoenzymes (isozymes) and in Arthrobacter genus in particularly.

What means multiple forms of enzyme or isoenzymes (isozymes)? The term

‗multiple forms of the enzyme‘ should be used as a broad term covering all proteins catalyzing the same reaction and occurring naturally in a single species. Multiple forms of enzymes may result from proteolytic or other irreversible modification under biological conditions. The term "isoenzyme" or "isozyme" should apply only to those multiple forms of enzymes arising from genetically determined differences in primary structure and not to those derived by modification of the same primary sequence [8].

The earliest report on multiple form of intracellular beta-galactosidase of Arthrobacter bacteria was published by Donnelly and colleagues (1977). Crude extract of bacterial cells induced with lactose contains at least 8 electrophoretically distinct and catalytically active forms of enzyme protein. Cell-free extract was purified by ammonium sulphate precipitation, chromatography on Sephadex G-200 and DEAE-Sephadex. The predominant fraction was found to consist of a single protein band corresponding to the active band of the greatest mobility. The enzyme is a tetramer (4 N) with molecular weight of 500 kDa characterized by pH optimum of

200