Научные стремления 2011-1

УДК 601.2:602.3

А.В. Сидоренко, Г.И. Новик

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИФИДОБАКТЕРИЙ

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

Актуальность. Бактерии рода Bifidobacterium используются для производства пробиотических препаратов и продуктов функционального питания. Согласно современным требованиям, штаммы бифидобактерий, применяемые в производстве, должны быть точно идентифицированы до уровня вида. Видовая дифференциация представителей рода Bifidobacterium на основании фенотипических признаков невозможна, и применение методов генотипирования для идентификации данных микроорганизмов является обязательной процедурой [1-4].

Цель исследования – использование методов генотипирования для идентификации культур Bifidobacterium, выделенных из различных источников, оценка их информативности для видовой дифференциации бифидобактерий.

Результаты и обсуждение. В качестве инструментов для идентификации бифидобактерий были выбраны методы двухлокусного секвенирования и ПЦР повторяющихся межгенных последовательностей (ERIC-ПЦР). Первый подход, предполагающий анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК как обязательного, и операционного гена tal, кодирующего трансальдолазу, как дополнительного филогенетического маркера, был применен группой российских исследователей для идентификации коллекционных, производственных и выделенных из кишечника детей штаммов Bifidobacterium [3]. Второй метод был успешно использован для видовой дифференциации типовых и вновь изолированных культур бифидобактерий [4].

Результаты идентификации бифидобактерий по данным двухлокусного секвенирования представлены в таблице. По данным анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммы, изолированные из фекалий людей, были идентифицированы как B. adolescentis, B. animalis, B. longum, из фекалий животных – B. animalis, B. boum, B. pseudolongum, B. thermophilum.

Культуры, изолированные из кисломолочных продуктов, были определены как

B. animalis, из пробиотических препаратов – B. longum, B. bifidum, B. angulatum.

Дифференцировать культуры B. longum, B. animalis, B. pseudolongum до уровня подвида не удалось из-за высокой (98-100%) внутривидовой гомологии гена 16S рРНК у представителей этих видов. Данные анализа нуклеотидной последовательности гена tal для штаммов Bifidobacterium sp. Н1, А4, В3, 4, N1, N10, N20 подтвердили результаты, полученные при секвенировании гена 16S рРНК. Штамм Bifidobacterium sp. Н3, идентифицированный по гену 16S рРНК как B. longum, по результатам анализа гена tal относился к виду B. adolescentis. Нуклеотидные последовательности гена tal культур Bifidobacterim sp. Н2, А6, И1, К3, К4, КО3, КО4, С6, 6, Д1, Д3, Д4, N5, N6 были на 99-100% гомологичны референтным последовательностям штаммов B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. longum, B. adolescentis, которые также характеризовались 98-100% сходством

241

между собой. Высокая межвидовая гомология нуклеотидных последовательностей гена tal не позволила использовать эту мишень для видовой дифференциации бифидобактерий. Схожие результаты получены группой российских ученых при идентификации типовых и выделенных из кишечника детей культур бифидобактерий [5]. Было показано, что межвидовая вариабельность операционных генов tuf, ptsG, dnaK у представителей рода Bifidobacterium соответствует внутривидовой вариабельности этих генов у других групп бактерий, и их анализ не может использоваться для видовой дифференциации бифидобактерий. Следовательно, видовая идентификация бифидобактерий должна основываться на данных анализа гена 16S рРНК, а анализ операционных генов, таких как tal, tuf, ptsG, dnaK является, скорее, инструментом для проведения филогенетических исследований и индивидуальной характеристики штаммов.

Таблица 1 – Результаты видовой идентификации бифидобактерий

С использованием метода ERIC-ПЦР для каждого вида бифидобактерий были получены специфичные ПЦР-фингепринты, в которых присутствовали как общие для вида, так и индивидуальные, характерные для конкретного штамма, полосы (рисунок). Результаты ERIC-ПЦР подтвердили результаты видовой идентификации бифидобактерий по данным анализа гена 16S рРНК. Так, штамм Bifidobacterium sp. Н3, идентифицированный по гену tal как B. adolescentis, имел ПЦР-фрагменты одинакового размера со штаммами B. longum, что, как и данные анализа гена 16S рРНК, свидетельствовало о его

242

принадлежности к этому виду. Использование ERIC-ПЦР позволило провести дифференциацию культур B. longum и B. animalis до подвидов B. longum ssp. longum – B. longum ssp. infantis, B. animalis ssp. animalis – B. animalis ssp. lactis,

неразличимых при анализе гена 16S рРНК, а также выявить различия бифидобактерий на уровне штаммов. Поскольку штаммоспецифичные полосы были получены не для всех культур, а в некоторых случаях одинаковые полосы были получены для разных штаммов, для типирования бифидобактерий на штаммовом уровне данные ERIC-ПЦР целесообразно дополнять данными, полученными при помощи других методов ПЦР-фингерпринтинга.

г

в

а) 1 – B. adolescentis ВКПМ АС-1662, 2 – B. adolescentis ГО-13, 3 – B. adolescentis Н1, 4 – B. longum ssp. longum ВКПМ АС-1665, 5 – B. longum ssp. infantis ВКПМ АС-1732, 6 – B. longum Н3, 7 – B. longum А4, 8 – B. longum В3, 9 – B. longum N1;

б) 1 – B. bifidum ВКПМ АС-1666, 2 – B. bifidum 791, 3 – B. bifidum ЛВА-3, 4 – B. bifidum N20, 5 – B. catenulatum ВКПМ АС-1732, 6 –B. angulatum N10, 7 – B. angulatum ВКПМ АС-1714; в) 1 – B. animalis ssp. lactis ВКПМ АС-1663, 2 – B. animalis ssp. lactis N5,

3 – B. animalis ssp. lactis N6, 4 – B. animalis H2, 5 – B. animalis A6, 6 – B. animalis И1,

7 – B. animalis ssp. animalis ВКПМ АС-1693, 8 – B. animalis ssp. animalis ВКПМ АС-1747, 9 – B. animalis K3, 10 – B. animalis KO3, 11 – B. animalis KO4, 12 – B. animalis Д1;

г) 1 – B. pseudolongum ssp. globosum ВКПМ АС-1752, 2 – B. pseudolongum С6, 3 – B. pseudolongum К4, 4 – B. boum Д3, 5 – B. boum Д4, 6 – B. boum 6,

7 – B. thermophilum ВКПМ АС-1746, 8 – B. thermophilum 4, М – маркер GeneRuler DNA Ladder Mix

Рисунок 1 – ERIC-профили бифидобактерий

Выводы. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК позволил идентифицировать исследуемые культуры бифидобактерий до уровня вида, однако не был информативным для их внутривидовой дифференциации. Анализ операционного гена tal не обладал достаточной разрешающей способностью для видовой идентификации бифидобактерий из-за высокой

243

межвидовой гомологии нуклеотидных последовательностей данного гена. Использование метода ERIC-ПЦР позволило провести дифференциацию культур B. longum и B. animalis до подвидов, а также выявить различия бифидобактерий на штаммовом уровне.

Литературные источники

1.Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание:

в3 т. / Б.А. Шендеров. – М.: Грантъ, 2001. – Т. 3: Пробиотики и функциональное питание. – 288 с.

2.Arunachalam, K.D. Role of bifidobacteria in nutrition, medicine and technology / K.D. Arunachalam // Nutr. Res. – 1999. – V. 19, №10. – P. 1559–1597.

3.Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы / М.Е. Карзанова [и др.] // Доклады РАСХН. – 2006. – №5. – С. 9–12.

4.Identification and tracing of Bifidobacterium species by use of enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences / M. Ventura [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2003.

– V. 69. – P. 4296–4301.

5.Полиморфизм генов бактерий группы Bifidobacterium adolescentis / О.Л. Воронина [и др.] // Санкт-Петербург – Пробиотики-2009: матер. 2-го междунар. конгресса по пробиотикам, Санкт-Петербург, 29–30 октября 2009 г. – Гастроэнтерология СанктПетербурга. – 2009. – №4. – С. М18.

A.V. Sidarenka, G.I. Novik

APPLICATION OF GENOTYPING METHODS

FOR BIFIDOBACTERIA IDENTIFICATION

Institute of Microbiology, National Academy of Sciences, Minsk

Summary

Cultures of bifidobacteria isolated from different sources were identified using genotyping methods. Usefulness of various approaches for species differentiation of these microorganisms was evaluated. 16S rRNA gene analysis allowed to identify bifidobacteria to the species level but failed their intraspecies differentiation. Sequencing of tal gene proved to be ineffective for bifidobacteria identification due to high interspecies homology of nucleotide sequences of this gene. ERIC-PCR was a powerful tool for interspecies differentiation of B. animalis and B. longum cultures, and allowed to distinguish between bifidobacteria stains.

244

УДК 58.02:581.14:631.8:612

А.А. Спицын 1, О.И. Пыхалов 2

ВЛИЯНИЕ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ ВОДНЫМИ РАСТВОРАМИ С МАЛЫМИ И СВЕРХМАЛЫМИ КОНЦЕНТРАЦИЯМИ

ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН ГОРОХА К СОВМЕСТНОМУ ДЕЙСТВИЮ ГИПОКСИИ И ГИПОТЕРМИИ

1Институт физиологии НАН Беларуси, Минск

2Белорусский государственный медицинский университет, Минск

Проблема влияния сверхмалых концентраций (СМК) биологически активных веществ (БАВ) исследуется уже более 20 лет [1]. За это время был накоплен определѐнный объѐм данных [2] и предпринят ряд попыток (пускай умозрительных) найти объяснение данному феномену [3,4]. Более полно с данным вопросом можно ознакомиться в нашем обзоре [2] и обзорах других авторов [1, 4, 6]. Парадоксален тот факт, что исследований, связанных с влиянием сверхмалых доз БАВ на растительные объекты, крайне мало. Между тем детальное изучение влияния сверхмалых концентраций регуляторов роста на прорастание семян, рост и развитие растений могло бы создать возможность разработки дешевых и экологически чистых препаратов для растениеводства. В этом нам видится актуальность нашего исследования.

Целью данной работы было проверить наличие зависимости между концентрацией экзогенной лимонной (2-гидрокси 1, 2, 3 поликарбоновой) кислоты (ЛК) (с учѐтом сверхмалых концентраций) и еѐ влиянием на морфофизиологические показатели проростков гороха в условиях комплексного воздействия гипоксии и гипотермии. Нами была выдвинута гипотеза, что лимонная кислота, являясь антиоксидантом, будет способствовать повышению устойчивости проростков к повреждающему мембраны комплексному стрессору. Нас так же интересовало: будет ли лимонная кислота эффективна в сверхмалых концентрациях и каков будет характер еѐ действия в различных концентрационных диапазонах.

Семена обрабатывали путѐм замачивания на 24 часа в растворе ЛК следующих концентраций: 10-20 М, 10-18 М, 10-16 М, 10-14 М, 10-12 М, 10-10 М, 10-8

М, 10-6 М, 10-4 М, контрольные семена замачивали в дистиллированной воде. Стресс вызывали по методу, описанному нами ранее [7]. Определяли всхожесть, массу проростка, длину главного корня, длину эпикотиля и выход свободных нуклеотидов из корней проростка [8].

Воздействие гипотермии и гипоксии приводило к снижению всхожести на 37%, повышению выхода свободных нуклеотидов на 345%, снижению длины корня на 62%. Также уменьшались длина эпикотиля (на 39%) и масса - на 28%. Обработка ЛК с применением разных ее концентраций приводила к уменьшению выхода нуклеотидов и увеличению всхожести семян в условиях гипоксии и гипотермии. В то же время у проростков, обработанных ЛК был более короткий эпикотиль. Самая высокая всхожесть наблюдалась при обработке ЛК в концентрациях 10-18 М, 10-14 М, 10-8 М, при этом у проростков

245

обработанных ЛК в концентрации 10-14 М корни оказались более длинными, чем у контроля (на 22%), и выход нуклеотидов самым низким из всех вариантов

(на 288% меньше, чем у контроля) (рисунок 1). Увеличение длины корня наблюдали также при концентрациях ЛК 10-14 М, 10-12 М, 10-8 М, 10-6 М и 10-4

М, а при обработке семян ЛК в концентрации 10-8 М значительно уменьшался выход нуклеотидов (на 203%). Нужно отметить, что при концентрации ЛК 10-4 М корни оказались самыми длинными (на 23% длиннее, чем у контроля) и при этом наблюдается снижение выхода нуклеотидов (на 200%). Таким образом, можно заключить, что водные растворы лимонной кислоты в концентрации 10- 14 М и 10-4М являются наиболее эффективными для повышения устойчивости прорастающих семян гороха к гипоксии и гипотермии. После обработки растворами ЛК в этих концентрациях наблюдалась самая высокая всхожесть, и корень был длиннее на 22-23%, чем у необработанных, а также снижался выход нуклеотидов из корней. В целом обработка растений лимонной кислотой во всех концентрациях приводила к повышению всхожести семян и увеличению массы проростков гороха в условиях гипоксии и гипотермии, однако средняя длина осевых органов на исследованных стадиях была меньше. Заслуживают внимания кривые зависимости всхожести и массы проростка от концентрации экзогенной лимонной кислоты, которые носят полимодальный характер. При данном количестве точек представляется возможным отметить четыре максимума этих двух кривых. При этом два максимума (соответствующие концентрациям 10-18 и 10-14 М) лежат в области сверхмалых концентраций, а два (10-8 М и 10-4 М) в области более высоких. Чѐтко выраженной "молчащей зоны", описанной в литературе, в данном случае не наблюдается. Речь, видимо, может идти о четырѐх пиках эффективности, разделѐнных несколькими диапазонами меньшей эффективности. Кривая зависимости выхода свободных нуклеотидов из клеток корней от концентрации лимонной кислоты носит характер обратный двум кривым, описанным выше. При этом минимальное значение выхода свободных нуклеотидов наблюдается при концентрациях лимонной кислоты 10-14 М, 10-8 М и 10-4 М. Всхожесть семян обратно коррелирует с уровнем выхода свободных нуклеотидов. Это факт может указывать на мембраннотропный механизм действия раствора лимонной кислоты, что и предполагается, исходя из антиоксидантных свойств лимонной кислоты. Вероятно, что всхожесть повышается за счѐт повышения устойчивости зародышевого корешка.

Однако следует отметить, что прямое соответствие минимумов выхода свободных нуклеотидов из корней и максимумов всхожести, не просматривается в диапазоне концентраций 10-20 -10-16 М, т.е. максимуму всхожести (10-18 М) не соответствует минимум выхода нуклеотидов из клеток корней. Это наводит на мысль о том, что смена характера концентрационной зависимости эффекта лимонной кислоты происходит в области 10-16 М, а не в области 10-12 М, как это описано для ряда других химических веществ.

246

Выводы. Во-первых, раствор лимонной кислоты в сверхмалых концентрациях, в том числе и в концентрации 10-20 М, способен повышать устойчивость прорастающих семян к холодовому и кислородному стрессору.

Во-вторых, раствор в концентрации 10-14 М является самым эффективным из исследованных нами при данных условиях.

В-третьих, характер взаимосвязи исследованных морфофизиологических

параметров отличается при действии лимонной кислоты в концентрациях 10-20- 10-16 М и в концентрациях 10-14 — 10-4М.

Литературные источники

1.Бурлакова Е.Б., Кондратов А.А., Мальцева Е.Л. // Химическая физика. 2003.Т.22, №2. C. 21—40.

2.Спицын А.А. // Ботаника (исследования): сборник научных трудов. 2008. Выпуск 36. С.473-486.

3.Блюменфельд Л.А. // Российский химический журнал. 1999. Т. 43, № 5. С. 15-20.

4.Ямскова В. П., И. А. Ямсков И. А. // Российский химический журнал. 1999. Т.43, №2. С.74-79.

5.Галль Л.Н., Галль Н.Р. // Биофизика. 2009. Т.54, №3. С.563-574.

6.Веселовский В.А., Веселова Т.В., Чернавский Д.С. // Российский Химический журнал. 1999. Т. 43, №5. С.49-54.

7.Спицын А. А., Пыхалов О. И. // Тезисы докладов второго международного симпозиума «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете. Казань 27-30 июня 2006 года. С. 209

8.Кабашникова Л. Ф. Способ ранней диагностики эффективности многокомпонентных капсулирующих составов для обработки семян. Минск. 2003. 31 с.

247

А.А. Spitsyn, O.I. Pykhalow

ЕFFECT OF LOW AND ULTRA-LOW CONCENTRATED CITRIC ACID WATER SOLUTIONS ON GERMINATING PEA SEEDS AND PEA SEEDLINGS

RESISTANCE TO HYPOXIC AND COLD COMPLEX IMPACT

Institute of Physiology, National Academy of Sciences, Minsk

2Belarusian State Medical University, Minsk

Summary

We investigated effect of low and ultra-low concentrated citric acid (CA) water solutions (1х10-20 —1х10-4 mol/1) on seed germination, pea seedlings growth and development, free nucleotide outflow from root cells under hypoxic and cold stress. We concluded that CA acts as physiologically active substance at ultra low concentration. CA water solution in concentrations 10-14, 10-4 mol/1 shows most stimulative effect on germination and root resistance forming of pea seeds and seedlings under hypoxic and cold.

248

УДК 547.914.4:615.07

О.В. Стасевич

ОЦЕНКА НЕОПРЕДЕЛЕННОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ СОДЕРЖАНИЯ ЛИГНАНА СЕКОИЗОЛАРИЦИРЕЗИНОЛА ДИГЛЮКОЗИДА

В СЕМЕНАХ ЛЬНА

Белорусский государственный технологический университет, Минск

Введение. В настоящее время в Республике Беларусь актуальным вопросом является идентификация биологически активных соединений в различных растениях. На основе растительного сырья, богатого такими соединениями, возможно создание лекарственных препаратов, биологически активных добавок, фитопрепаратов. В плане характера воздействия на организм, лекарственные средства растительного происхождения имеют ряд преимуществ перед синтетическими аналогами, как правило, они имеют мягкий, более выраженный терапевтический эффект [1, 2].

Лигнаны – природные фенольные соединения, обладающие широким спектром биологической активности, содержащиеся в различных органах некоторых растений. Семена льна масличного богаты лигнаном секоизоларицирезинола диглюкозидом (СДГ). Данное соединение обладает антиоксидантным, противоопухолевым и антимикробным действием. На основе семян льна, а также лигнана СДГ возможно создание фитопрепаратов и лекарственных средств, поэтому точность определения данного компонента, как в препарате, так и в исходном сырье является актуальным вопросом [1, 2]. В соответствии с национальным стандартом СТБ ИСО/МЭК 17025 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий» оценка точности результата измерений должна сопровождаться расчетом неопределенности.

Неопределенность (измерения) – это параметр, связанный с результатом измерения и характеризующий разброс значений, которые с достаточным основанием могут быть приписаны измеряемой величине. В отличие от погрешности этот параметр характеризует более широкий разброс значений и помогает определить истинное значение измеряемой величины.

Цель данной работы – выявление, анализ и количественная оценка неопределенности измерений содержания лигнана СДГ в семенах льна.

Материалы и методы. Количественное содержание СДГ в семенах льна в расчете на обезжиренное сырье (мг/г) определяли методом ВЭЖХ. Условия проведения анализа представлены в [2]. Перед проведением анализа проводили пробоподготовку, то есть получали лигнанобогащенные экстракты. Общая схема получения лигнансодержащих экстрактов включала в себя следующие стадии: измельчение и обезжиривание семян льна, высушивание, взвешивание, экстракцию водно-этанольной смесью, совмещенную со щелочным гидролизом [2].

В данной работе применялся модельный подход для оценки неопределенности. Были выявлены источники неопределенности, рассчитаны

249

стандартные, суммарная и расширенная неопределенности. Стандартные неопределенности рассчитывали на основании статистического распределения результатов ряда наблюдений (по типу А), а также на основании предполагаемых распределений вероятностей, основанных на опыте (по типу Б)

[3].

Результаты и их обсуждение. Выявленные источники неопределенности при анализе содержания СДГ в семенах льна методом ВЭЖХ и результаты их расчета представлены в таблице.

Таблица 1 − Количественные характеристики источников неопределенности измерений содержания СДГ в семенах льна

Как видно из таблицы 1, в процессе подготовки пробы для анализа неопределенность вносит погрешность калибровки весов при определении массы обезжиренных семян, фактор неполного высушивания семян, фактор экстракции, фактор гидролиза. Неопределенностью последних факторов пренебрегали в расчете на то, что гидролиз, экстракция и высушивание проходят полностью. Количество СДГ, содержащееся в экстракте, находили с помощью построенной градуировочной зависимости. С этой целью были приготовлены четыре градуировочных раствора с концентрациями 200, 100, 50, 25 мкг/мл из исходного основного раствора с концентрацией СДГ 1000 мкг/мл. Приготовление градуировочных растворов также вносит вклад в неопределенность измерений. На концентрацию основного раствора влияет степень чистоты коммерческого препарата СДГ (ChromaDex, США), погрешность калибровки пипет-дозатора (перед поставкой дозаторы

250