Научные стремления 2011-1

УДК 619 :616.981.48.576

М.М. Мистейко, А.Ю. Финогенов, А.П. Лемиш, Е.Г. Финогенова

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТА ПО ПРИМЕНЕНИЮ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА С/Х ЖИВОТНЫХ

РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского», г. Минск, Республика Беларусь

Введение. Свиноводство и скотоводство являются одними из важнейших отраслей современного сельского хозяйства. В последние годы достигнуты определенные успехи в изучении инфекционных заболеваний свиней как вирусной, так и бактериальной природы. Однако по мере организации эффективных систем и методов борьбы с одними болезнями, приобретают важное значение другие. К таким болезням относится и пастереллез c/х животных, который регистрируется в хозяйствах республики. Многолетний опыт использования вакцинации как средства специфической профилактики пастереллезной инфекции свидетельствует о сохранении ее весомой роли [2].

Решение проблемы борьбы с пастереллезом осложняется тем, что патогенные пастереллы длительное время сохраняясь в организме не только переболевших и бывших с ними в контакте здоровых животных, а также в организме синантропных животных и птиц, создают своеобразный стационарный эпизоотический очаг [3, 4].

В настоящее время для борьбы с пастереллезом в нашей стране используются противопастереллезные вакцины, но эффективность их не высока, т.к. заболеваемость и летальность по-прежнему на высоком уровне [1].

Важным моментом биотехнологии производства пастереллезной вакцины является оптимизация процентного содержания микробных клеток на единицу объема дозы введения вакцины и отработка режимов эмульгирования, которые позволили бы достигать высокой иммуногенности вакцины.

Цель исследования: изучить влияния различных концентраций микробных клеток и дозы введения вакцины на уровень выработки защитных антител.

Материалы и методы исследований. Определение антигенной активности инактивированной вакцины против пастереллеза свиней проводили на поросятах. Сравнительную эффективность антипенных свойств пастереллезной вакцины проводили на шести опытных и одной контрольной группе поросят по 15-20 голов в каждой группе. Животным I-й опытной группы вакцину вводили в дозе 1 см2 однократно в концентрации 1 млрд. м.к., II - в дозе 2 см2 однократно в концентрации 1 млрд. м.к., III - в дозе 1 см2 однократно в концентрации 2 млрд. м.к., IV - в дозе 2 см2 однократно в концентрации 2 млрд. м.к., V - в дозе 1 см2 однократно в концентрации 5 млрд. м.к., VI - в дозе 2 см2 однократно в концентрации 5 млрд. м.к., VII - в дозе 2 см2 инъецировали физиологический раствор (контроль). До введения образцов вакцины провели отбор проб крови, для определения состояния иммунитета. Спустя 21, 60, и 105

91

дней после введения образцов вакцины отбирали пробы крови, сыворотку которой исследовали в реакции РА (реакция агглютинации).

Результаты исследований и обсуждение. При испытании вакцины с различной концентрацией микробных клеток (м.к.) и дозой введения установили, что вакцинация в дозе 2 см2 и 1 см2 однократно в концентрации 5 млрд. м.к. обладает реактогенностью, на месте введения наблюдали повышение температуры и образование асептических абсцессов у 60% животных. Концентрация 1 и 2 млрд. м.к. в дозе вакцины являются безвредными, так как после их введения поросятам мы не отмечали видимых отклонений от нормы. Общая и местная температурная реакция у них не выходила за пределы нормы.

Одновременно вакцина с различной концентрацией микробных клеток и дозой введения вызывала стимуляцию иммунной системы организма, что сопровождалось выработкой специфических антител (таблица 1).

Таблица 1 - Средние титры антител в сыворотке крови поросят после введения различного количества пастереллезного антигена , log2

Как видно из таблицы 1 уровень антител в сыворотке крови был разным и зависел от концентрации микробных клеток и дозы введения. До вакцинации у поросят был не высокий титр антител (кроме группы I), через 21 день после вакцинации наиболее высокие титры были в группах II, III , IV - 7,6±0,24 log2, 6,6±0,51 log2 и 6,6±0,40 log2 соответственно, но во всех группах наблюдался защитный титр антител. Через 60 дней после вакцинации также во всех группах сохранялся защитный титр антител, наиболее высокий он был в группах I, II - 6,4±0,60 log2 и 6,4±0,40 log2 соответственно. На 105 день после вакцинации титр антител значительно снизился, но был на уровне защитного в группе IV, V - 5,0±0,45 log2 и 3,8±0,20 log2 соответственно. В контрольной группе поросят на протяжении 60 дней опыта титр антител был не высоким, тогда как на 105 день, он резко увеличился с 2,0±0,52 log2 до 7,0±0,55 log2, что может свидетельствовать о заболевании пастереллезом этих животных.

Полученные результаты исследований дали основание заключить, что наименьшее негативное влияние на антигенные свойства вакцины оказывает концентрация микробных клеток в вакцине 1 млрд. м.к. в 1 см2 при дозе вакцины 1-2 см2 на голову. Уровень антител в сыворотке крови поросят этой

92

группы оказался оптимально приближенным к результатам полученным после иммунизаци в дозе 5 млрд. м.к. в 1 см2 при дозе вакцины 1-2 см2 на голову.

Вывод: наиболее оптимальной концентрацией микробных клеток в вакцине является 1 млрд. м. к. в 1 см2 при дозе вакцины 1-2 см2.

Литературные источники

1.Кисленко В.Н., Колычев Н.М. и др. Ветеринарная микробиология и иммунология. – М., 2007.

2.Сосницкий А.И. Серомониторинг респираторной патологии с доминантным участием в этиопатогенезе Pasteurella multocida / Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету. Серія Ветеринарні науки // Луганськ: «Елтон-2». –

2008. - №92. – С. 202-209.

3.Derosa D.C., Mechor G.D., Staats J.J., Chengappa M.M., Shryock T.R. Comparison of Pasteurella species simultaneously isolated from nasal and tracheal swabs from cattle with clinical signs of bovine respiratory disease. J. Clin. Microbiol., 2000, 38(1), 327-332.

4.Younan, M., Fodor, L., 1995. Characterization of a new Pasteurella serotype (A17). Res. Vet. Sci. 58, 98.

M.M. Mistejko, A.J. Finogenov, A.P. Lemish, E.G. Finogenova

RESULTS OF EXPERIENCE ON APPLICATION OF A VACCINE AGAINST ПАСТЕРЕЛЛЕЗА AGRICULTURAL ANIMALS

Institute of experimental veterinary science of S.N.Vyshelessky, Minsk, Byelorussia

Summary

Important point of biotechnology of manufacture the pasterellosis vaccines is optimisation of percentage of microbic cages on unit of volume of a dose of introduction of a vaccine. Our researches have been directed on studying of influence of various concentration of microbic cages and a dose of introduction of a vaccine on level of development of antibodies. The received results of researches have given the basis to conclude, that the least negative influence on antigene properties of a vaccine is rendered by concentration of microbic cages in a vaccine of 1 billion in m. to. In 1 sm2.

93

УДК 637.14.04/.07: 637.133:637.07

И.В. Подорожняя

КРИОСКОПИЯ КАК МЕТОД КОНТРОЛЯ ПИТЬЕВОГО МОЛОКА

Белорусский государственный технологический университет, Минск

Введение. Безопасность продукта напрямую зависит от свойств используемого сырья и эффективности контроля его качества по ограниченному числу показателей. Объектом исследования было выбрано питьевое коровье молоко – ценный продукт питания повседневного спроса. Одним из принятых методов его контроля является криоскопия, позволяющая оперативно обнаруживать фальсификации по точке замерзания продукта. Для сырого молока в настоящее время накоплено достаточно данных. Однако для термообработанных продуктов, поступающих в продажу, таких данных недостаточно.

Целью исследования было нахождение связи между температурой замерзания и другими физическими параметрами термообработанного молока в процессе его хранения.

Материалы и методы исследования. Температуру замерзания молока определяли криоскопическим методом на миллиосмометре-криоскопе термоэлектрическом МТ-5-01 (С.-Пб.). Другие физические параметры, в частности, удельную электропроводность, измеряли настольным кондуктометром HI 2300 HANNA Instruments (ФРГ) с автоматической температурной компенсацией (25°С). Анализ доли свободной воды вели методом точки росы на охлаждаемом зеркале путем измерения показателя

«активность воды» на приборе Roremeter RM-10 фирмы NAGY Messsysteme GmbH. Активную кислотность молока определяли рН-метром HI 221 HANNA Instruments с автоматической температурной компенсацией (25°С), а титруемую кислотность – по ГОСТ [1].

В качестве объектов исследования были выбраны молоко коровье питьевое пастеризованное, ультрапастеризованное и стерилизованное. Образцы готовой продукции наиболее крупных производителей закупались в различной потребительской таре объемом 1 литр в розничной торговой сети Минска по два образца одной партии. После отбора проб для анализа молоко в закрытой потребительской таре хранили в течение 26 – 34 суток при комнатной температуре и в холодильнике.

Результаты исследования и обсуждение. Средние измеренные значения физических показателей закупленных образцов питьевого молока, подвергающегося различным видам термической обработки, приведены в таблице 1.

Полученные данные показывают, что температура замерзания термически обработанного молока намного выше, чем для молока-сырья, которая по национальному стандарту [2] не выше – 0,52°С, что согласуется и с литературными данными [3].

94

Таблица 1 – Средние начальные значения показателей питьевого молока

Причины расхождения, очевидно, связаны с изменениями физикохимических свойств молока при термической обработке: денатурации белков; частичного разложения лактозы при стерилизации с последующим увеличением кислотности молока на 2–3°Т; выпадения минерального осадка вследствие перехода растворимых солей кальция и фосфора в нерастворимое состояние; удаления летучих веществ и газов [3].

При разных способах термической обработки молока получены различные температуры замерзания образцов.

Титруемая кислотность всех образцов питьевого молока соответствовала требованиям национального стандарта – не превышала 21°Т [4].

Термическая обработка не приводит к существенным изменениям рН образцов, что подтверждается литературными данными [3]. Вследствие удаления CO2 рН пастеризованного молока немного повышается, а затем понижается из-за одновременного образования коллоидного фосфата кальция, сопровождающийся выделением водородных ионов.

Значения удельной электропроводности питьевого молока соответствовали приведенным в литературных источниках средним значениям данного показателя для сырого молока, что говорит об отсутствии влияния термической обработки молока на наличие и концентрацию диссоциированных солей [3].

Следовательно, термическая обработка молока оказывает наибольшее влияние на концентрацию молочного сахара – лактозу.

Активность воды в пастеризованном молоке имеет примерно такой же уровень как и в сыром молоке: от 0,990 до 0,995. С увеличением температуры тепловой обработки активности воды несколько падает, что, возможно, связано

снезначительным уменьшением количества свободной влаги из-за испарения.

Впроцессе хранения образцов молока наблюдались понижения температуры замерзания и рН, увеличение удельной электропроводности и титруемой кислотности, за исключением показателя «активность воды», для которой явная зависимость не установлена.

При комнатной температуре хранения изменения параметров наблюдались быстрее и сильнее, чем при хранении в холодильнике. Однако, при хранении ультрапастеризованного и стерилизованного молока различных производителей на холоде все значения измеряемых показателей оставались постоянными в течение 18 – 21 дней, а при комнатной температуре хранения –

95

от 4 до 18 суток (рисунок 1), очевидно, из-за меньшего исходного количества микроорганизмов, чем в пастеризованном молоке. При дальнейшем хранении на холоде наблюдались постепенные изменения измеряемых параметров.

За исключением параметра «активность воды», изменения остальных параметров происходили по линейному закону независимо от режима хранения. Поэтому полученные зависимости были объединены в один график.

На рисунке 2 изображены зависимости температуры замерзания термообработанного молока в процессе хранения от титруемой кислотности и от показателя «активность воды», а в таблице 2 приведены уравнения зависимостей температуры замерзания молока от различных параметров.

Продолжительность хранения, суток

Рисунок 1 - Зависимость температуры замерзания питьевого ультрапастеризованного молока от температурного режима и продолжительности хранения

Рисунок 2 - Зависимость температуры замерзания термообработанного молока в процессе хранения от а) титруемой кислотности; б) показателя «активность воды»

Таблица 2 – Виды линейных уравнений зависимостей температуры замерзания молока от различных параметров

Как видно из данных таблицы, криоскопический метод анализа молока может применяться для определения высоких значений титруемой кислотности. В меньшей степени температура замерзания молока взаимосвязана с активной кислотностью и удельной электропроводностью. Явная зависимость между температурой замерзания и параметром «активность воды» не установлена.

Выводы. Термическая обработка не оказывает существенного влияния на удельную электропроводность и активную кислотность образцов молока. Температура замерзания термически обработанного молока сильнее обусловлена продолжительностью выдержки молока при нагревании и содержанием лактозы, чем концентрацией диссоциированных солей. Активность воды образцов молока тем ниже, чем выше температура тепловой обработки.

В процессе хранения молока происходили понижение температуры замерзания и рН, а также увеличение удельной электропроводности и титруемой кислотности.

Литературные источники

1.Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности: ГОСТ 3624-92. – Введ. 01.01.94. – Москва: Изд-во стандартов, 2004. – С. 22-29.

2.Молоко коровье. Требования при закупках: СТБ 1598-2006. – Введ. 01.08.06. – Минск: Госстандарт, 2006. – 15 с.

3.Твердохлеб, Г. В. Химия и физика молока и молочных продуктов / Г. В. Твердохлеб, Р. И. Раманаускас. – М.: ДеЛи принт, 2006. – 360 с.

4.Молоко питьевое. Общие технические условия: СТБ 1746-2007. – Введ. 01.10.07. – Минск: Госстандарт, 2007. – 12 с.

I.V. Podorozhniaya

CRYOSCOPY AS A METHOD OF FLUID MILK CONTROL

Belarusian State Technological University, Minsk

Summary

The article introduces data on freezing point, apparent and active acidities, electrical conductivity and water activity of pasteurized, ultra-high-pasteurized and sterilized milk. The mentioned kinds of milk has been stored at room temperature and in refrigerator. The reasons of the differences are given. The cryoscopic method is shown to be the most perspective method for fluid milk quality control.

97

УДК 619:578.824.11:615.371

И.А. Пунтус

ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСА РРСС В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК MARC-145

РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского», Минск

Введение. Для специфической вакцинопрофилактики репродуктивнореспираторного синдрома свиней применяются как живые, так и инактивированные вакцины [1]. Инактивированная вакцина должна обладать высокой иммуногенной активностью [2]. Количественное накопление вируса напрямую зависит от используемой культуры клеток.

Проведенные нами опыты позволили подобрать оптимальную клеточную модель – перевиваемую культуру клеток MARC-145 для культивирования вируса РРСС. Титр инфекционной активности штамма КМИЭВ-V112 на культуре клеток MARC-145 после четвертого пассажа составил 4,75±0,25 lg

ТЦД50/мл.

Целью наших исследований являлось определение оптимальных параметров культивирования вируса РРСС, в связи с чем, изучалась динамика накопления вируса в культуре клеток MARC-145 при различной множественности заражения и сроке культивирования.

Материалы и методы. В опытах использовались: перевиваемая линия клеток MARC–145, являющаяся пермиссивным клоном культуры клеток почки обезьяны макаки-резус Ма-104; питательная среда ИглаMEM+DMEM (1:1) с добавлением Hepes-буфера 10 мМ (рН среды 7,0–7,3); сыворотка эмбриональная крови крупного рогатого скота (2-5%); вирус репродуктивно респираторного синдрома (РРСС) штамм КМИЭВ-V112.

Перевиваемую культуру клеток MARC–145 выращивали при температуре +37оС в 1,5-литровых матрасах Ру, посевная концентрация 125±5 тыс.кл./мл

(18,75 млн.кл/матр.).

При проведении первой серии экспериментов нами были выбраны 4 группы матрасов с монослоем клеток, сформированным на 85–100%. В первой группе матрасов вирус РРСС штамм КМИЭВ-V112 вносили в дозе 0,1 ТЦД50/кл. Во второй группе множественность заражения составила 0,2 ТЦД50/кл, в третьей – 0,5 ТЦД50/кл, а в четвертой – 1,0 ТЦД50/кл.

Культивирование зараженного монослоя клеток продолжали при температуре

+37оС.

Через 24, 36, 48, 72 и 96 часов после заражения вирусом снимали по 3 матраса в заморозку (–40°С, 48 часов), после разморозки отбирали вируссодержащий материал для определения титра инфекционной активности вируса на культуре клеток MARC-145. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера и выражали в lg ТЦД50/см3.

Во второй серии экспериментов при определении оптимального способа накопления вирусной биомасссы были сформированы 3 группы матрасов. В первую группу матрасов вносили культуру клеток MARC-145 из расчета в

98

125±5 тыс. кл/мл (18,75 млн. кл/матр.). К 48–60 часам культивирования в матрасах формировался 85–100% монослой. Ростовая среда сливалась, а на монослой вносили вирус РРСС КМИЭВ-V112 в дозе 0,5 ТЦД50/кл. После контакта вируса с клетками в течение 60 минут при температуре (+37±0,5оС) вносили поддерживающую питательную среду с 2% эмбриональной сыворотки крови КРС.

Во вторую группу матрасов вносили культуру клеток MARC-145 из расчета в 125±5 тыс. кл/мл (18,75 млн. кл/матр.). К 24 часам культивирования в матрасах формировался 50–60% монослой. Не сливая ростовую питательную среду инокулировали вирус в дозе 0,5 ТЦД50/кл.

Во третью группу матрасов вносили одновременно культуру клеток MARC-145 из расчета в 125±5 тыс.кл/мл (18,75 млн.кл/матр.) питательной среды с содержанием 10% эмбриональной сыворотки крови КРС и РРСС штамм КМИЭВ-V112 в дозе 0,5 ТЦД50/кл.

Матрасы культивировали до 80-90% видимого поражения монослоя, замораживали при температуре (-40°С). Через 48 часов размораживали и проводили отбор проб для определения инфекционной активности на культуре клеток MARC-145. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера и выражали в

lg ТЦД50/мл.

Контроль стерильность вирусной суспензии проводили посевами на плотные и жидкие питательные среды: МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и агар Сабуро.

Результаты исследований и обсуждение. Количество клеток в матрасах на момент заражения 22±0,5 млн.кл. через 48 часов культивирования. Динамика накопления вируса РРСС штамм КМИЭВ-V112 приведена в таблице 1.

Таблица 1 – Динамика накопления вируса РРСС штамм КМИЭВ-V112 при монослойном стационарном культивировании линии клеток MARC-145

Как видно из таблицы, скорость накопления вируса зависит от множественности заражения и срока культивирования вируса. Так, при множественности заражения 0,1 ТЦД50/кл и 0,2 ТЦД50/кл накопление вируса в культуре происходило медленнее и достигло максимального титра через 96 часов инкубирования (5,25±0,15 lg ТЦД50/мл и 5,5±0,15 lg ТЦД50/мл соответственно). При последующем культивировании увеличение титров не наблюдалось. В третьей опытной группе (0,5 ТЦД50/кл) максимальный титр вируса был получен через 48 часов и составил 5,5±0,1 lg ТЦД50/мл. В

99

последующие 24 часа его увеличение не отмечалось, а через 96 часов после инокуляции происходило снижение титра вследствие инактивации. В четвертой опытной группе максимальный титр инфекционной активности вируса при множественности заражения 1,0 ТЦД50/кл отмечался уже через 24 часа культивирования (5,25±0,2 lg ТЦД50/мл), но через 72 часа также отмечалось снижение титра.

Общепринято накопление вируса РРСС двумя способами: заражение на сформированный монослой клеток (на 80-100%) со сменой ростовой среды или внесение вирусного материала одновременно с суспензией клеток [3].

Исходя из литературных данных, нами была проведена серия опытов по накоплению вируса РРСС при инокуляции вируса во взвесь клеток, а также на монослой сформированный на 50-60% и на 80-100%.

Результаты опыта заражения культуры клеток MARC-145 во взвесь растущих клеток и на монослой приведены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты опыта культивирования вируса РССС штамм КМИЭВ-V112 при заражении во взвесь растущих клеток и на монослой

Из таблицы 2 следует, что заражение во взвесь клеток в дозе 0,2 и 0,5 ТЦД50/кл не обеспечивало полного поражения монослоя за 168 часов вследствие подавления роста клеток. При множественности заражения 1,0 ТЦД50/кл срок культивирования сокращался до 120 часов, но титр инфекционной активности вируса был не высокий – 4,0±0,1 lg ТЦД50/мл.

Инокуляция вирусной суспензии из расчета 0,5 ТЦД50/кл на монослой, сформированный на 50-60% позволяло накапливать вирус в титре 4,25±0,15 lg,

1,0 ТЦД50/кл – 4,0±0,12 ТЦД50/мл, 0,2 ТЦД50/кл – так же 4,0±0,1 ТЦД50/мл, однако время культивирования увеличивалось до 168 часов.

При множественности заражения 0,5 ТЦД50/кл на сформированный монослой видимое поражение 80-90% клеток происходило за 48 часов, инфекционная активность накапливаемого вируса составляла 5,5±0,11 lg ТЦД50/мл.

100