Выявление генетических маркеров в реакции гибридизации нуклеиновых кислот

Рисунок 1. Схемы проведения реакции гибридизации нуклеиновых кислот

В фильтрационном тесте образцы ДНК денатурируют и наносят на мембрану. Проводят инкубацию фиксированных образцов с ДНК-зондами, меченными радиоактивным изотопом P³². Промывают мембрану для удаления не связавшихся зондов. Положительные образцы выявляют путем авторадиографии. Возможно использование флюоресцентных ДНК зондов, в этом случае учет результатов реакции проводится в люминесцентном микроскопе. При гибридизации in situ манипуляции с ДНК проводят в интактных образцах ткани, фиксируемых на предметном стекле. После инкубации с ДНК-зондом на стекло наносят фотографическую эмульсию. В зонах радиоактивной эмиссии (т.е. там, где произошла гибридизация) на ней проявляются темные микроскопические гранулы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР – исскуственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro.

Исходные компоненты ПЦР

Рисунок 2. Исходные компоненты ПЦР (схема)

ДНК-матрица - ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент.

Праймеры - синтетические олигонкулеотиды (последовательности из 20-35 нуклеотидов), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации и определяет качество проводимого анализа.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - смесь четырех видов нуклеотидов А, Г, Ц, Т, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

Фермент Taq-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК.

Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Весь технологический процесс исследования с использованием полимеразной цепной реакции включает:

1) подготовку образца – выделение ДНК и ее очистка;

2)проведение самой полимеразной реакции, направленной на умножение (амплификацию) фрагментов ДНК возбудителя заболевания;

3) оценку результата.

Для проведения полимеразной реакции используется специальное устройство - термоциклер, позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси.

Каждый цикл ПЦР включает три этапа (см. схему):

1 этап. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при t 93-95^оС в течение 30-40 сек.

2 этап. Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65^оС. Время отжига -20-60 сек.

3 этап. Элонгация (достраивание цепей ДНК). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты ( дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72^оС. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Рисунок 3. Схема полимеразной цепной реакции

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации. Накопление ампликонов в растворе происходит по формуле 2ⁿ, где n-число циклов амлификации. Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК амплификация включает 20-40 циклов.

Оценка результата

Результаты ПЦР анализируют с помощью метода электрофореза в агаровом геле или иммуноферментного анализа.

ЗАНЯТИЕ № 7

ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИОТЕРАПИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ. АНТИСЕПТИКА.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Противомикробные мероприятия. Влияние экологических факторов на микробы. Действие физических факторов (температуры, высушивания, излучений, ультразвука, осмотического давления). Действие химических факторов.

2. Цели, способы, средства и объекты стерилизации и дезинфекции в медицинской и микробиологической практике. Контроль качества дезинфекции. Контроль стерилизации и стерильности. Способы проведения.

3. Антисептика. Определение. Антисептические средства, требования, происхождение, свойства, группы, механизмы действия на микробы. Типы антисептики. Терапевтическая антисептика. Профилактическая антисептика.

4. Химиотерапевтические препараты. Свойства. Основные группы химиопрепаратов. Механизмы действия на бактерии. Понятие об избирательности и "мишенях" действия.

5. Органические и неорганические соединения металлов и металлоидов. Сульфаниламидные препараты. Препараты нитрофуранового ряда. Противогрибковые, противовирусные, противопаразитарные химиопрепараты.

6. Антибиотики. Определение. Продуценты антибиотиков. Синтетические и полусинтетические антибиотики.

7. Основные группы антибиотиков по химической структуре. Бета-лактамные антибиотики Тетрациклины. Аминогликозиды. Макролиды и азолиды. Анзамицины (рифампицины). Левомицетин. Фторхинолоновые антибиотики. Линкомицин. Полимиксины. Гликопептиды

8. Классификация антибиотиков про механизму действия на бактериальную клетку.

9. Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

10. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам и другим химиопрепаратам. Техника постановки, учета и оценки чувствительности методом дисков, Е-теста, серийных разведений.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1► Впишите в таблицу возможные способы и режимы стерилизации указанных объектов:

Стерилизуемые объекты	Способы и режимы стерилизации
Бактериологические петли
Перевязочный материал (марля, вата, бинт)
Резиновые, пластиковые изделия
Стеклянные изделия
Основные питательные среды (МПА, МПБ)
Питательные среды, содержащие белок
Растворы, содержащие вещества, которые инактивируются при температуре свыше 60оС