Загальні відомості

Для хроматографічного розподілу амінокислот в суміші та їх кількісного визначення застосовується метод розподільної хроматографії на папері, запропонований у 1944 р. Мартіном і Сінджем, який базується на розподілі речовин рухомої фази відносно нерухомого носія в залежності від їх спорідненості з носієм. Амінокислоти можуть бути розподілені між двома рідкими фазами, що не змішуються, в таких системах як фенол-вода абон-бутанол-вода. Розчинені амінокислоти розподіляються між рівними обємами двох рідин. Відношення концентрацій амінокислоти у рідких фазах, що знаходяться у стані рівноваги при даній температурі називається коефіцієнтом розподілу. Кожна амінокислота має характерний тільки для неї коефіцієнт розподілу, що відповідає даній парі розчинників. Якщо одна речовина з низьким коефіцієнтом розподілу Z рухається по хроматографічному папері швидше ніж речовина Y, що має більш високий коефіцієнт розподілу, то через деякий час ці речовини повністю розділяться. При цьому спостерігається концентрація кожної речовини в певному місці у вигляді плями.

За напрямком руху елюента паперову хроматографію так як і тонкошарову за рухомою фазою розділяють на висхідну, низхідну і радіальну (кругову) паперову хроматографію:

- якщо елюент рухається по паперу знизу вверх, хроматографія називається  висхідною(а) паперовою хроматографією;

- якщо зверху вниз - низхідною(б) паперовою хроматографією;

- у методі радіальної паперової хроматографії (в) використовується паперове коло (г) з гнотом, опущеним у елюент (рис. 2.1 та 2.2).

Рис.2.1. Радіальна хроматографія: А - місце нанесення зразка, 1- хроматографічний папір, 2 - фітіль для подачі розчинника; 3 - розчинник

Рис. 2.2. Розділення пігментів чорнил методом радіальної тонкошарової хроматографії

Іноді складну багатокомпонентну суміш не вдається розділити на компоненти за допомогою одного розчинника. Тоді застосовують  двовимірну хроматографію. Хроматографічне розділення такої суміші проводиться послідовно в двох напрямках на квадратному листку хроматографувального паперу з використанням двох різних систем розчинників. В такому випадку одержуємо двовимірну карту розташування різних амінокислот.

У кут квадратного аркуша хроматографічного паперу наносять розчин проби і хроматографують спочатку в одному напрямку з певним елюентом, а потім, повертають хроматографічний папір на 90^оі хроматографують в іншому напрямку з іншим елюентом (рис 2.3.).

Рис. 2.3. Розподіл суміші 22 вільних амінокислот методом двовимірної хроматографії на папері

Перший елюент проводить попереднє розділення компонентів проби, другий остаточне розділення суміші на компоненти. Місцеположення кожного з компонентів суміші визначають хімічними або фізико-хімічними методами.

В якості носія нерухомої фазивикористовується чиста целюлоза у вигляді спеціального фільтрувального паперу, який повинен бути особливо чистим та мати дуже рівномірно розподілену щільність. Целюлоза, з якої складаються волокна фільтрувального паперу, що застосовується в хроматографії, знаходяться в гідратованому стані. В міру того як розчинник, що містить суміш амінокислот, рухається під дією капілярних сил по листку паперу, проходить безліч мікроскопічних актів розприділення амінокислот між рухомою фазою та стаціонарною фазою, повязаною з волокнами бумаги. В кінці цього процесу різні амінокислоти проявляються на різній відстані від старту.

Існує кілька різновидів хроматографічного паперу, який відрізняється товщиною та щільністю:

• папір № 1 та 2 менш щільний і називається "швидким";

• папір № 3 і 4 — "повільним".

Звичайні сорти паперу гідрофільні і містять до 20-22 % вологи. Тому при використанні води як нерухомої фази спеціального зволоження для хроматографічного паперу не потрібно.

Метод кількісного визначення амінокислот в розподільній хроматографії на папері застосовуєтся для після їх хроматографічного розділення.

В основі методу лежить реакція амінокислоти з нінгідрином. Усі вільні a - амінокислоти дають з нінгідрином синьо-фіолетове забарвлення. Реакція характерна для аміногруп, які знаходяться в a - положенні і використовується для виявлення a - амінокислот. Реакція проходить у слабокислому середовищі з подальшим перетворенням отриманого в результаті реакції нестійкого похідного міді синьо-фіолетового кольору — дикетогідринделідендикетогідрин-диамін (ДІДА) в стабільне похідне міді оранже­во-червоного кольору, яке має максимум поглинання при 530 нм. Кількісне визначення амінокислот базується на вимірюванні оптичної густини Cu-похідного ДІДА після його екстракції з паперу. Лінійна залежність між вмістом амінокислот у плямі та оптичною густиною забарвлення знаходиться між 0,025 та 0,25 мкмоль амінокислоти.

Метод застосовується для визначення всіх амінокислот, за ви­нятком проліну і оксипроліну, які інакше реагують з нінгідрином і утворюють похідне міді іншої будови.