Методом Лоурі

Розчин БСА (мл)	Фіз.р-н (мл)	Кільк. білку (мг/мл)	Поглинання
0,025	0,975	0,025
0,05	0,950	0,05
0,1	0,9	0,1
0,2	0,8	0,2
0,3	0,7	0,3
0,4	0,6	0,4
0,5	0,5	0,5

До 1 мл білкового розчину додають 4 мл суміші розчинів А и В. Струшують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі. Потім швидко доливають 0,4 мл реактиву Фоліна, енергійно перемішують і залишають на 30-90 хв для розвитку забарвлення. Жовте забарвлення розчину поступово переходить у синє. Оптичну щільність розчину вимірюють на фотоелектро-колориметрі при 750 нм (червоний світлофільтр), кювета 5 мм.

За одержаними даними будують калібрувальну криву. Величину поглинання відкладають по осі ординат, а відповідну їй концентрацію білку в пробі по осі абсцис.

Аналогічно будується калібрувальна крива для методу Бредфорда.

Хід роботи

Визначення невідомих концентрацій білкових розчинів.

Метод Лоурі. Для аналізу беруть три пробірки на 10 мл (1-ша контроль, 2-га та 3-тя розчини білків невідомої концентрації). В дослідні пробірки вносять 0,4 мл розведеного в кілька разів розчину білку невідомої концентрації, а в контрольну – 0,4 мл фізіологічного розчину або води. У всі пробірки доливають по 2 мл реактиву 3, перемішують і залишають на 10 хвилин. Потім швидко доливають 0,2 мл реактиву 4, перемішують, витримують 30 - 40 хв. і вимірюють поглинання проти контрольної проби (1-ша пробірка, де замість білку додавали 0,4 мл води або фізіологічного р-ну) при 750 нм (червоний світлофільтр), кювета 5 мм.

Вміст білку в розчинах невідомої концентрації знаходять за калібру-вальною кривою (рис.7.2). Для цього величину поглинання для кожної проби знаходять на осі ординат, з’єднують цю точку горизонтальною прямою з калібрувальною кривою і з точки перетину опускають перпендикуляр на вісь абсцис. Точка перетину перпендиуляра з віссю абсцис покаже вміст білку в пробі в мг/мл. Потім роблять перерахунок концентрації білку з урахуванням розведення.

ΔD

0,1 0,2 0,3

концентрація білку, мг/мл

Рис. 7.2. Визначення концентрації білку за калібрувальною кривою

Метод Бредфорда. Для аналізу беруть три пробірки на 10 мл (1-ша контроль, 2-га та 3-тя розчини білків невідомої концентрації). В дослідні пробірки вносять 0,5 мл розведеного в кілька разів розчину білку невідомої концентрації, а в контрольну – 0,5 мл фізіологічного розчину або води. В кожну пробірку додають 0,5 мл реагента і перемішують. Забарвлення розвивається протягом 5-30 хв. Вимірюють поглинання проти контрольної проби при 595 нм в кюветі 1 мм. Вміст білку знаходять за калібрувальною кривою побудованою для методу Бредфорда.

При визначенні білку за даним методом потрібно пам'ятати, що реагент дуже чутливий до слідових кількостей білку (1-2 мг/мл). Посуд, фільтр, кювети для роботи повинні бути абсолютно чистими. Кювети після кожного вимірювання бажано мити спиртом, оскільки кумассі сорбується на склі, що завищує показання приладу.