Флуоресценція хлорофілу
Флуоресценція є свіченням активності речовин при поглинанні ними світла. Флуоресценція хлорофілу, не будучи фотосинтетично утилізованою формою енергії, служить ознакою його фотохімічної активності.
В темряві молекула хлорофілу знаходиться в основному стані з найнижчим енергетичним рівнем валентних електронів. При поглинанні кванта світла один з π-електронів молекули хлорофілу переходить на більш високий енергетичний рівень, внаслідок чого виникає електронно-збуджений стан молекули. При поверненні із збудженого стану в основний енергія електронів може витрачатися на: 1) фотохімічну роботу, 2) збудження сусідніх молекул хлорофілу, 3) втрату у вигляді тепла, 4) флуоресцентне випромінювання. Незалежно від довжини хвилі спектр флуоресценції хлорофілу а має максимум при 670 нм. Хлорофіл сильно флуоресцирує в розчинах і слабо — в листі, що пояснюється щільною упаковкою молекул в тілакоїдах і використанням поглиненої енергії у фотохімічних процесах.
Хід роботи
Витяжку пігментів в пробірці помістити на темному фоні у світлі настільної лампи або освітити пучком світла проекційного ліхтаря. Розглянути витяжку з тієї сторони, звідки падає світло (рис.4.4.).
Рисунок. 4.4. Спиртна витяжка хлорофілу у відбитому (а) і прямому промінні (б):
1 — світло лампи, що освітлює пробірку з розчином хлорофілу та збуджує його флуоресценцію;
2 — світло лампи, що проходить через пробірку з розчином хлорофілу;
3 — світло лампи, відбите від пробірки;
4 — флуоресценція хлорофілу.
Завдання: відзначити забарвлення розчину і зробити висновок про причину флуоресценції.
4.1.5 Кількісне визначення пігментів
Матеріали і обладнання: 1) свіже листя різних світлолюбних і тіньовитривалих рослин; 2) 80% ацетон або спирт; 3) СаСОз; 4) коренеплоди моркви або гарбуза; 5) кварцовий пісок або товчене скло; 6) терези; 7) ножиці; 8) ступки малого розміру; 9) реактив Гьотрі; 10) фільтрувальний папір; 11) скляні палички; 12) мірні колби на 25 мл з пробками; 13) воронки; 14) ФЕК або СФ; 15) міліметрівка; 16) вазелін; 17) серветка; 18) очищений бензин.
4.1.5.1 Визначення вмісту хлорофілу
Вміст хлорофілу в листі залежить від умов освітлення і мінерального живлення, віку листя і ряду інших зовнішніх і внутрішніх чинників. При точних визначеннях спочатку виділяють хлорофіл хроматографічним методом або шляхом його омилення. При порівняльних дослідженнях можна визначити вміст хлорофілу в спиртній або ацетоновій витяжці без попереднього розділення пігментів.
Відомо, що хлорофіли мають максимум поглинання в червоній частині спектру, тоді як супутні їм пігменти не поглинають довгохвильове проміння. Тому при роботі на ФЕКі з використанням червоного світлофільтру або на спектрофотометрі можна достатньо точно визначити вміст хлорофілів, не відділяючи їх від каротиноїдів.
Щоб уникнути втрат хлорофілу всі операції необхідно проводити швидко, в затемненому приміщенні, бажано на холоді.
Хід роботи
1.Отримання витяжки хлорофілу
Подрібнити листя ножицями, відкинувши черешки і крупні жилки, і відважити 300-500 мг. Помістити наважку в ступку, додати кварцового піску або товченого скла і трохи СаСОз, підлити 4-5 мл 80% ацетону або спирту і ретельно розтерти. Змазати знизу носик ступки вазеліном і злити витяжку по паличці у воронку з фільтром (змоченим 80% ацетоном) в мірну колбу на 25 мл, не втрачаючи жодної краплі. Відфільтрувати. Підлити в ступку ще небагато ацетону, розтерти, знову відфільтрувати. Повторити цю операцію 2—3 рази, потім перенести розтерту масу на фільтр. Сполоснути ступку 3 рази ацетоном, злити матеріал у воронку, дати постояти декілька хвилин і відфільтрувати. Промити матеріал ацетоном до повного виділення пігментів (розчинник, що стікає з фільтру, повинен стати безбарвним).
Довести ацетоном витяжку до мітки. Закрити мірну колбу пробкою, ретельно перемішати (перевернути 3 рази вверх дном і збовтати) і берегти до визначення в темряві на холоді.