2. Визначення ліполітичної активності насіння

Матеріали і обладнання: 1) центрифуга на 15 тис. обертів; 2) пластмасові центрифужні пробірки з кришками на 10 мл: 3) термостат: 4) аналітичні терези; 5) бюретка для титрування на 10 мл: 6) колби на 50 мл; 7) пробірки: 8) ступки або випарювальні чашки; 9) цитрат-фосфатний буфер з рН 4,6 (51,8 мл 2,87% розчини Nа₂НР0₄ і 48,2 мл 2,1% розчини лимонної кислоти (для льону олійного); 10) цитрат-фосфатний буфер з рН 4,8 (50,7 мл 2,87% розчини Nа₂НР0₄ і 49,3 мл 2,1% розчини лимонної кислоти (для рицини); 11) 0.5 % розчин фенолфталеїну на 60% С₂Н₅0Н; 12) 0,2% розчин NаОН для титрування; 13) насичений розчин NaCl, який містить 0,05% тритон Х-100.

Для культур, які накопичують жири як запасний матеріал (льон, соняшник, рицина) дуже важливим показником є ліполітична активність насіння. Від цього показника залежить життя цих рослин на початкових етапах розвитку, коли рослина ще живиться гетеротрофно, за рахунок поживних речовин насіння.

Важливим моментом у визначенні ліполітичної активності є виділення ліпази у відносно чистому вигляді. Для цього її активують, створивши середовище з відповідною кислотністю. Для різних видів і навіть сортів вона різна, але знаходиться в діапазоні 4,2 - 5,2 рН. Активна ліпаза переходить безпосередньо в шар жиру, де починає розщеплювати його. Методом центрифугування відділяють шар жиру від водного. З шару жиру осаджують активну ліпазу насиченим розчином NаС1. Активність ліпази визначають титруванням 0,2% розчином NаОН.

Хід аналізу

1. Екстракція кислої ліпази насіння

Наважку (5 г) подрібненого насіння розтирають з невеликою кількістю цитрат-фосфатного буферу до гомогенного кашоподібного стану. Потім цю суміш поміщають в центрифужні пробірки і центрифугуют при 15 тис. об/хв. 15 хвилин.

Після центрифугування суміш розділяється на три шари: верхній - жировий, який містить слиз, жир та ліпазу; середній - водний, який містить водорозчинні речовини; нижній - осад.

Для виділення кислої ліпази беруть верхній жировий шар, додають до нього насичений розчин NaCl, який містить 0,05% тритон Х-100, щоб розділити слиз, жир та ліпазу (1:1 за об'ємом), збовтують суміш і центрифугують 15 хв. при 13 тис. об/хв. Утворюються 4 шари: верхній, який містить слиз; жировий шар, який містить олію; водний і осад (ліпаза). Для аналізу потрібен тільки жировий шар і осад ліпази, який розчиняють в 0,5мл буферу.

2. Визначення ліполітичної активності

В дві пробірки поміщають по 0,5 мл цитрат-фосфатного буфера, по 0,5 мл розчину ліпази і по 3 краплі олії, яка була взята з жирового шару. Одну з цих пробірок поміщають на інкубацію в заздалегідь нагрітий до 37°С термостат на 1 годину (дослід). До іншої пробірки (контроль) додають 2 краплі 0,5% розчину фенолфталеїну (розчин при цьому каламутніє) і титрують 0,2% розчином NаОН до появи стійкого блідо-рожевого забарвлення.

Після інкубації титрується і дослідна проба. За різницею між витраченим на титрування досліду і контролю NаОН розраховується ліполітична активність (мл\год).

Завдання: визначити ліполітичну активність даного насіння.