Biodiversity2013

«Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.» Odessa, 2013

Зогляду на це метою роботи було перевірити інгібуючу та стимулюючу роль аутоіндуктора нізину у формуванні біоплівки L. lactis (De Ruyter O., 2008).

В стерильний 48-луночний полістироловий плоскодонний планшет вносили по 1 мл середовища ТДЕС у кожну лунку. Після цього у лунки додавали по 50 мкл суспензії мікроорганізму з концентрацією 2·104 клітин/мл. До усіх лунок, окрім контрольних, додавали по 20 мкл досліджуваної концентрації нізину (0,001-10 мг/мл). Планшети інкубувалися при температурі 30оС протягом 48 годин. Після закінчення терміну інкубації вимірювали оптичну густину зразків на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм.

Суттєве збільшення інтенсивності формування біоплівки було відмічене

узразках з додаванням нізина з концентрацією 100 нг/мл. Помітно низька активність утворення біоплівки відмічена у зразках з додаванням нізина концентраціями 5 мкг/мл та 10 мкг/мл.

Інші досліджувані концентрації нізина показали незначний інгібуючий ефект; в цілому, зниження активності утворення біоплівки відмічалося на рівні 10-15% (окрім досліджуваної концентрації 2,5 мкг/мл, додавання якої знизило інтенсивність формування біоплівки на 35%).

Зогляду на отримані дані є доречним подальше вивчення впливу аутоіндуктора нізину на формування біоплівки Lactococcus lactis.

Lactococcus lactis biofilm formation under the autoinducer nisin influence

Semenets A.S.

Autoinducer added in the concentration range of 0,001-10 mg/ml. About the nisin activity judged by the presence of the optical density difference between the experimental and control samples. The significant increase of biofilm formation was in samples with nisin added concentration of 100 ng/ml. Low activity of biofilm formation noted in the samples with added concentrations of 5 mg/ml and 10 mg/ml.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ

НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ В ДОННЫХ ОСАДКАХ БУХТЫ СЕВАСТОПОЛЬСКОЙ (ЧЁРНОЕ МОРЕ)

Тихонова Е.А., Бурдиян Н.В.

Институт биологии южных морей имени А.О. Ковалевского НАН Украины, Севастополь, Украина

E-mail: tihonoval@mail.ru

Донные осадки представляют собой динамическую систему со сложными физико-химическими условиями, от которых зависит бактериальное население. При избыточном поступлении в донные отложения антропогенных углеводородов в них начинают преобладать восстановительные условия среды, благоприятные для жизнедеятельности анаэробных микроорганизмов. Учитывая, что большинство донных осадков прибрежной зоны акватории

240

Microbiology and virology

Севастополя обладают восстановительными условиями среды (Миронов, 2003), можно предположить, что процесс самоочищения от углеводородов нефти будет протекать за счет деятельности анаэробных бактерий, в частности сульфатредуцирующих.

Целью работы было оценить зависимость численности сульфатредуцирующих бактерий от уровня нефтяного загрязнения донных отложений.

Пробы донных осадков были отобраны во время проведения плановой санитарно-биологической съёмки в летний период в 2009 г. на станциях, предусмотренных схемой мониторинга. Отбор проб и последующая обработка материалавеласьпостандартнымметодикам(Тихонова,2013,Нетрусов, 2005).

Как показали наши исследования, донные осадки бухты Севастопольской различаются по содержанию нефтяных углеводородов. Наибольшее их содержание определено в центральной части бухты Севастопольской, а также в бухтах Южной и Артиллерийской, входящих в акваторию б. Севастопольской. В частности, максимальные значения достигают до 1369,5; 1260,0 и 189,3 мг/100 г возд.-сух. д.о. соответственно.

Численность сульфатредуцирующих бактерий колебалась от 1 до 2500 кл./г, причём их максимум определен в донных осадкахсповышеннымсодержанием нефтяных углеводородов (бухты Южная, Артиллерийская и центральная часть бухты Севастопольской).

Анализ данных, полученных на станциях в б. Севастопольской, показал прямоевзаимодействиемеждусодержаниемнефтяныхуглеводородоввдонных осадках и численностью сульфатредуцирующих бактерий. Коэффициент корреляции равен 0,75 (n=10, Р<0,05).

Таким образом, полученные результаты свидетельствует об участии сульфатредуцирующих бактерий в биодеградации нефтяных углеводородов в донных отложениях.

The quantitative distribution of sulfate-reducing bacteria, depending on the content of oil hydrocarbons in the sea-bottom sediments of Sevastopol bay

(Black Sea)

Тykhonova E., Burdiyan N.

The abundance of sulfate-reducing bacteria inhabiting sea-bottom sediments and concentrations of oil hydrocarbons of Sevastopol bay (Black Sea) were investigated. The correlation between bacterial abundances and oil hydrocarbon concentrations measured in the sea-bottom sediments was computed.

241

«Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.» Odessa, 2013

ПОШУК ШТАМІВ ЛАКТОБАКТЕРІЙ, ПЕРСПЕКТИВНИХ ДЛЯ ВИКОРИСТАННЯ У ВИРОБНИЦТВІ ТВЕРДИХ СИРІВ

Циганенко Т.С., Кігель Н.Ф.

Національний університет харчових технологій, Київ, Україна Одеський національний університет імені І.І. Мечнікова, Одеса, Україна

Однією з причин зниження якості твердих сичужних сирів з тривалим терміном визрівання є забруднення молока спороутворювальними бактеріями родуClostridium ssp. Режимитепловоїобробки,якізастосовуютьувиробництві сиру (72-76 0С з витримкою 20 с) не знешкоджують спор маслянокислих бактерій. Останні, розвиваючись у сирній масі, спричиняють маслянокисле бродіння під час якого відбувається анаеробне розщеплення лактатів у масляну кислоту, яка надає сиру неприємного прогірклого присмаку та формування рваного малюнка. Водночас утворюється значна кількість молекулярного водню, що спричиняє ваду «пізнє здуття» та може призвести до розриву сирної головки (Шульга Н. 2011).

Перспективним напрямком запобігання розвитку маслянокислого бродіння у сирах є використання заквашувальних культур зі штамів лактобактерій з високим рівнем антагоністичної активності щодо маслянокислих бактерій, насамперед Clostridium tyrobutyricum як найбільш шкодочинного представника клостридій (Julien M. 2008).

Метоюроботибулоздійснитипошуклактобактерій-антагоністівклостридій, перспективних для залучення до складу захисної культури антибактеріальної дії для виробництва твердих сичужних сирів. З природних джерел (сирі молоко домашні сири та квашена капуста) було вилучено 50 ізолятів лактобактерій. З використанням методу лунок здійснено тестування даних культур на здатність пригнічувати розвиток маслянокислих бактерій. За цією ознакою відібрано 8 найбільш активних штамів L. plantarum. Зона пригнічення росту клостридій відібраними штамами лактобактерій становила 20-23 мм. Також встановлено, щоприспільномукультивуванніштамівL.plantarum таClostridium tyrobutyricum за анаеробних умов ріст даних тест-культур пригнічувався не менше ніж на 3 порядки.

Searched lactobacteriumi of clostridia antagonists that are looking to attract to the protective culture antibacterial action for cheese

Tsiganenko T., Kigel N.

It was searched lactobacterium of clostridia antagonists that are looking to attract to the protective culture antibacterial action for cheese. According to the research were selected eight cultures L. plantarum, which can inhibit the development of collection strains of Clostridium tyrobutyricum.

242

Microbiology and virology

АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА МНОГОШТАММОВОЙ КОМБИНАЦИИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Швец С1., Бурец Е1., Коев Г1., Бурцева С2.

1Научно Исследовательский Институт Садоводства, Виноградарства и Пищевых Технологий 2Институт Микробиологии и Биотехнологии Академии Наук Молдовы

E-mail: ssval1@rambler.ru

От качественного состава, количественного содержания, физиологобиохимических свойств и активности молочнокислых бактерий, входящих в состав микрофлоры «стартерных» культур во многом зависит качество молочнокислых продуктов и их безопасность.

Известно, что многие штаммы молочнокислых бактерий обладают антимикробной активностью.

Влаборатории «Пищевой биотехнологии» НИИСВПТ проводились исследования по выявлению антимикробных свойств многоштаммовой комбинации молочнокислых бактерий составленной из культур Отраслевой Коллекции промышленных микроорганизмов (Lactococcus lactis ssp.lactis, Lactococcus lactis ssp.cremoris, Lactococcus lactis ssp.lactis biovar diacetylactis),

предназначенной для производства ферментированных молочных продуктов. Исследования проводились методом агаровых блоков по Н. Егорову (2004).

Врезультате исследований выяснилось, что испытуемая комбинация подавляет рост Pseudomonas aeruginosa (диаметр зоны лизиса - 15,0 мм), Staphylococcus aureus (диаметр зоны лизиса - 15 мм), Proteus vulgaris (диаметр зоны лизиса - 14 мм), Escherichia coli (диаметр зоны лизиса - 13 мм), Salmonella enterica ssp. enterica sv. аbony (диаметр зоны лизиса - 11 мм).

Таким образом, антимикробный потенциал созданной комбинации молочнокислых бактерий оценен как средний. Это предполагает, что культура способна подавить развитие кишечных инфекций, а продукты, выработанные

сее использованием будут обладать определенным антимикробным эффектом для человека.

Antimicrobial properties combination of lactic acid bacteria Svets S., Burets Е., Coev G., Burtseva S.

Studied and identified antimicrobial activity combination of lactic acid bacteria to pathogenic test cultures.

243

«Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.» Odessa, 2013

БИОГЕННЫЕ ПОЛИАМИНЫ КАК МОДУЛЯТОРЫ БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ ESCHERICHIA COLI

Широкова О.А.1,2, Нестерова Л.Ю.2, Ткаченко А.Г.1,2

1Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия; 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия.

E-mail: olga.shirockova@gmail.com

Вприроде до 99 % микроорганизмов существуют в форме биопленок

–бактериальных сообществ, развивающихся на границе раздела сред. Формирование биопленок является причиной снижения чувствительности

микроорганизмов к антибактериальным препаратам, что может привести к возникновению персистирующих инфекций и увеличению затрат на медикаментозноелечение.Регуляциябиопленкообразования(БП)малоизучена, однако, за последние несколько лет значительно вырос интерес к биогенным полиаминам (ПА) как к возможным факторам, определяющим процессы БП.

Проведенные нами исследования показали, что ПА путресцин, спермидин и спермин значительно стимулируют образование биопленок. Нами сделано предположение о том, что ПА обладают способностью стимулировать БП, повышая уровень экспрессии гена rpoS. Продукт данного гена, белок RpoS, контролируетоколо10%геномаEscherichia coli,втомчисле,гены,участвующие в БП. Последующие исследования подтвердили, что сверхэкспрессия rpoS увеличивает БП в 2,5 раза. Из исследованных нами ПА только путресцин положительно модулировал экспрессию rpoS, тогда как спермидин и спермин, наоборот, снижали ее. Таким образом, положительный эффект ПА на БП лишь частично можно объяснить повышением уровня экспрессии rpoS .

Изучение биопленок при помощи световой микроскопии показало, что увеличение БП при внесении полиаминов происходило за счет возрастания количестваклетоквбиопленке.КоличествоКОЕвпленкетакжеувеличивалось при добавке путресцина и спермидина в концентрации 10 мМ и спермина в концентрации 1 мМ на 95, 65 и 50%, соответственно. При этом возрастания количества КОЕ в планктоне при добавке ПА не наблюдалось.

Таким образом, внесенные в среду ПА стимулируют БП E. coli. Вероятно, механизмом, лежащим в основе данного эффекта, является модулирующие действие ПА на экспрессию генов, задействованных в БП, в том числе, находящихся под контролем RpoS.

Работа выполнена по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (проект № 12-П-4-1047) и поддержана грантами РФФИ №№ 11-04-9600, 13-04-96002 и грантом молодых ученых УрО РАН №18.

Biogenic polyamines as an Escherichia coli biofilm formation’s modulators

Shirokova O.A., Nesterova L.Yu., Tkachenko A.G.

PolyamineswereshowntoelevatebiofilmformationofE. coli indose-dependent manner. It was found that growth with polyamines leads to CFU’s amount rising in

244

Microbiology and virology

biofilms. Polyamines’positive effect on biofilm formation seems to be greatly based on modulation of gene expression, particularly rpoS regulon.

МИКРООРГАНИЗМЫ ВЫЗЫВАЮЩИЕ ГНИЕНИЕ КОРНЕЙ ВИНОГРАДА ПОСЛЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ФИЛЛОКСЕРОЙ

Шихлинский Г.М., Мамедова Н.Х.

Институт Генетических Ресурсов НАН Азербайджана, Баку, Азербайджан

E-mail: sh.haci@yahoo.com

В виноградарских хозяйствах Тертерского района из корней винограда, пораженных филлоксерой сорта Баяншира, Тебризи и Хиндогни были взяты образцы для определения видового состава микроорганизмов (грибы

ибактерии), вызывающих гниение корней винограда, как вторичный патологический процесс.

Микроорганизмы, выделенные из пораженных филлоксерой корней винограда сорта Баяншира составили 100%. Из них фитопатогенные грибы, относящиесякродуGliocladium–15%,грибыродаCylindrocarpon–17%игрибы рода Fusarium–23%. В то же время, было установлено, что на корнях этого сорта винограда имеются бактерии, относящиеся к роду Pseudomonas–12%

ибактериии рода Bacillus–15%. Из сапротрофных грибов выявлено наличие рода Absidia – 1%, Mucor–6,5%, Molissia–3%, Penicillium–5%. Больше всего из микроорганизмов у сорта Баяншира встречались фитопатогенные грибы рода Fusarium–23%, фитопатогенные бактерии рода Bacillus–15%.

Микроорганизмы, выделенные из поврежденных вредителем корней винограда сорта Тебризи составили 94%. Из них 27 % были фитопатогенные грибы рода Gliocladium, 33%-грибы рода Cylindrocarpon и 10%-грибы рода Fusarium. А также, было выявлено наличие фитопатогенных бактерий, относящихся к роду Pseudomonas–6% и бактерий рода Bacillus–15%. И наконец, на корнях этого сорта винограда присутствовали сапротрофные грибы рода Penicillium–5%, грибы рода Mucor–4%, Molissia–3% и грибы рода Rhacodiella–2%. На корнях винограда сорта Тебризи фитопатогенные грибы рода Cylindrocarpon и сапротрофные грибы рода Penicillium, в отличии от других микроорганизмов, составили большинство и равнялись соответственно 33% и 5%. А также, фитопатогенные бактерии рода Bacillus составили 15%.

Микроорганизмы, выделенные из пораженных филлоксерой корней винограда сорта Хиндогни составили 98%. Было выявлено, что из них 27% были фитопатогенные грибы рода Gliocladium, 13%-рода Cylindrocarpon и 40% грибов, относящихся к роду Fusarium, также имелись фитопатогенные бактерии рода Bacillus–25%, а наличие бактерий, относящихся к роду Pseudomonas не было выявлено. Из сапротрофных, установлено присутствие грибов рода Penicillium–3,5%, Mucor–2,5%, Absidia–3%, Molissia–2% и Rhacodiella–3%.

245

«Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.» Odessa, 2013

Microorganisms caused rotting the root of grape by Phylloxera Shikhlinski H., Mamedova N.

Phytopathogen fungus species: Fusarium, Gliocladium, Cylindrocarpon; phytopathogen bacterium species: Pseudomonas, Bacillus; saprotroph fungus species: Mucor, Absidia, Molissia, Penicillium and Rhacodiella caused rotting the roots of grape by phylloxera were determined in Tartar region ofAzerbaijan.

НОВІ ПОТЕНЦІЙНО НЕБЕЗПЕЧНІ ВІРУСИ ТА БАКТЕРІЇ ОВОЧЕВИХ КУЛЬТУР ДЛЯ АГРОЦЕНОЗІВ УКРАЇНИ

Юсько Л.С., Бокшан О.Я., Садляк А.М.

Закарпатський територіальний центр карантину рослин ІЗР НААН України, Ужгород, Україна

E-mail: lesjusko@mail.ru

Нещодавно Європейська організація карантину та захисту рослин повідомила про наявність ряду нових збудників бактеріозів (Acidovorax citrulli, Xanthomonas axonopodis pv. alli, Candidatus Liberibacter solanacearum) та вірозів (Iris yellow spot virus, Tomato torrado virus, Pepino mosaic virus, Tomato apical stunt pospiviroid) на овочевих культурах. Аналітичний огляд літератури показав відсутність досліджуваних організмів на території України. Метою нашихдослідженьбуловстановитичистановлятьданізбудникихвороброслин фітосанітарний ризик для овочевих агроценозів України. Основними шляхами поширення даних організмів є інфіковані плоди, насіння, цибулини, зовнішні ознакиураженняякихможутьбутивідсутніми,щоперешкоджаєїхсвоєчасному виявленню. Аналіз даних Держкомстату України відносно імпорту рослинної продукції, з якою можуть асоціювати вище зазначені організми, свідчать про неодноразове її надходження з країн, в яких вони присутні. Так, лише за 20072010 роки в Україну ввозились цибулини, бульбоцибулини, саджанці та ін. з Австрії, Бельгії, Ізраїлю, Мексики, Нідерландів, Німеччини, Перу, Польщі, Угорщина, Франції, Чилі. Таким чином існує реальна загроза проникнення цих патогенівнатериторіюнашоїдержави.Враховуючитойфакт,щовУкраїнітретє місце в посівах займають картопля і овоче-баштанні культури (2185 тис. га, що становить 7,2 % всієї посівної площі), а економічні збитки від досліджуваних патогенів в їх сучасних ареалах складають від 30 до 100 %, при їх інтродукції в Україну можна очікувати значних економічних та соціальних збитків (втрата ринків збуту, робочих місць тощо).

На основі одержаних даних зроблено висновок про те, що всі досліджувані збудники бактеріозів та вірозів становлять потенційний фітосанітарний ризик для України і вони можуть мати статус регульованих шкідливих карантинних організмів. Застосування фітосанітарних заходів, які можливі лише при технічному обґрунтуванні, забезпечить захист овочевих культур країни. Дослідження в цьому напрямку в Україні проводяться вперше, містять новизну, є актуальними і будуть використані в практиці фітосанітарної служби України.

246

Microbiology and virology

New potentially dangerous viruses and bacteria of vegetables for agrocenosis Ukraine

Yusko L.S., Bokshan O.Y., Sadlyak A.M.

The studies allowed to categorize Acidovorax citrulli, Xanthomonas axonopodis pv. alli, Candidatus Liberibacter solanacearum, Iris yellow spot virus, Tomato torrado virus, Pepino mosaic virus, Tomato apical stunt pospiviroid as potential quarantine harmful organisms. Such researches in Ukraine are the first, contain novelty, are relevant and will be used in the practice of Phytosanitary Service of Ukraine.

ВИВЧЕННЯ АНТИБІОТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ЕКСТРАКТІВ КВІТІВ ДИКОРОСЛИХ ТА КУЛЬТУРНИХ РОСЛИН ЩОДО ТЕСТ-КУЛЬТУРИ

BACILLUS SUBTILIS

Ярошко О.М., Шепелевич В.В., Гриценко Л.М., Яворська Н.В.

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, ННЦ «Інститут біології», кафедра мікробіології та загальної імунології, НДЛ

«Мікробіологічних та імунологічних проблем біотехнології», Київ, Україна

E-mail: 90tiger90@mail.ru, vshepelevich@ukr.net

Починаючи з 2006 року популяція бджіл у Європі та Америці стрімко скорочується. Причини цього явища поки до кінця не з'ясовані, проте науковці висловлюють думку про те, що воно може бути викликане вірусними та бактеріальними захворюваннями, кліщами, шкодою від використання пестицидів та від випромінювання стільникового зв'язку, вирощуванням генетично модифікованих рослин, іншими факторами. Існують припущення, що масова загибель бджіл може бути пов'язана з загибеллю різнотрав'я і його заміною монокультурами.

Метоюнашоїроботибулодослідженняантибіотичноїактивностіекстрактів квітів дикорослих та культурних рослин щодо тест-культури Bacillus subtilis УКМ В-901. В роботі використовували квіти 110 дикорослих, культурних, декоративних видів рослин, зібрані в червні-жовтні 2013 року в Києві, Київській та Луганській області. 1 грам квітів заливали 2 мл етилового спирту, гомогенізували, отримували спиртовий екстракт, який наносили на паперові диски. З добової культури мікроорганізму готували інокулюм на стерильному фізіологічному розчині за стандартом мутності 5 одиниць, 1-2 краплі бактеріальної суспензії розтирали скляним шпателем по поверхні чашки Петрі зсередовищемМюллера-Хінтона.Дискизекстрактамирозкладалипоповерхні середовища з культурою, витримували 24 год в термостаті за 37оС, реєстрували зони затримки росту культури.

Показано,щоекстракти30видіврослинпроявлялиантибіотичнуактивність щодо тест-культури, зони затримки росту становили 7-25 мм.

Найбільш активними виявилися екстракти квітів осоту польового, вербозілля лучного, гортензiї великолистої, звіробою звичайного, квасениці прямостоячої, злинки канадської, горошку мишачого, пижма звичайного, плетухи звичайної, троянди дамаської, ромашки без’язичкової, скерди

247

«Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.» Odessa, 2013

колосовидної, спiреї японської, cуріпиці звичайної, дереві́ю звичайного, чини лучної,чистотілувеликого.Такимчиномможназробитиприпущення,щолише різноманіття диких і культурних рослин може забезпечити бджіл біологічно активними речовинами, які б могли захистити їх від захворювань.

The study of antibiotic activity of plant extracts (of wild and cultivated plants) against the test culture of Bacillus subtilis

Yaroshko O.M., Shepelevych V.V., Gritsenko L.M., Jaworska N.V.

It has been shown that the extracts of 30 species of plants among 110 surveyed showed antibiotic activity against the test culture Bacillus subtilis, in which growth stunted zones were 7-25 mm. The most active extracts were Hypericum perforatum, Oxalis stricta, Erigeron canadensis, Vicia cracca, Matricaria discoidea, Chelidónium május. This it can be assumed that only the diversity of wild and cultivated plants can providebeeswithbiologicallyactivesubstancesthatcouldprotectthemfromdiseases.

Β GALACTOSIDASE GENE EXPRESSION UNDER THE CONTROLOF

PBIO-PROMOTER IN THE CELLS OFB. SUBTILIS

Chepisiuk N.V.

Belarusian State University, Minsk, Republic of Belarus

E-mail: Natalia_Chepisiuk@mail.ru

Bacillus species are attractive industrial organisms for a variety of reasons. Much is known about the biochemistry, physiology, and genetics of B. subtilis and other species, which facilitates further development and exploitation of these organisms in industrial processes. In genetic engineering of B. subtilis, plasmid backbone and promoter are two basic elements to be taken into consideration while developing the strategy of recombinant strain construction. There is a number of hybrid commercial promoters used for directed expression of cloned genes in the cells of B. subtilis, but the number of native promoters used for this purpose is still very limited.

Pbio-promoter is a promoter of B. subtilis biotin-biosynthesis operon bioWAFDBI. The promoter is negatively regulated by biotin. Nowadays Pbio promoter is not applied for target geterologous gene expression. In order to examine the possibility of Pbio promoter application for geterologous gene expression we constructed recombinant strains B. subtilis 2W2 and B. subtilis A2M1. B. subtilis 2W2 and B. subtilisA2M1 contain marker-gene lacZ placed under the control of Pbio promoter at the distance of 400 and 2200 bp from the promoter start, respectively. According to natural negative regulation of Pbio promoter by biotin, the expression of lacZ could be regulated by endogenous biotin. We carried out a comparative analysis of β galactosidase activity assay under repression and derepression conditions in B. subtilis 2W2 and B. subtilis A2M1. Cultivation of bacteria was carried out in the medium supplemented with chromogenic substrate X gal for the detection of lacZ activitywithexogenousbiotinandwithoutthevitamin.β galactosidaseactivityassay inthecellsofB.subtilis2W2andB.subtilisA2M1underrepressionandderepression conditions revealed that the expression of lacZ is regulated by endogenous biotin

248

Microbiology and virology

in both strains and proved that Pbio-promoter is able to control geterologous gene expression in-between 400 and 2200 bp from the promoter start at the same level.

PRODUCTION OFVIRUS-FREE PROPAGATION STOCK OFAPPLE,

PEAR, PLUM AND CHERRY TREES IN THE CZECH REPUBLIC

Chroboková E., Suchá J., Ludvíková, H., Vacková, H., Talácko, L.,

Karešová R., Křivohlávková L., Nováková D., Babec V.

Research and Breeding Institute of Pomology Holovousy Ltd., Holovousy, Czech

Republic

E-mail: chrobokova.vsuo@seznam.cz

Because of the long term use of woody perennial fruit crops, it is important to start with clean material, which can be reliably obtained only through certification schemes. In the Research and Breeding Institute of Pomology (RBIP) Holovousy Ltd., located in the Czech Republic, production of virus-free propagation stock of apple, pear, plum and cherry trees was conducted according to the certification schemes (EPPO 2001a, EPPO 2001b, EPPO 2001c) between 2002-2012. Testing on woody indicators is a classic biological indexing method based on the double budding technique. First the indicator must be inoculated on a virus free rootstock every August and then, 10-14 days after the inoculation, the candidate plants were inoculatedundertheindicator.Afteratleast2-3years,itispossibletoclearlyevaluate thesignsofthediseaseonthewoodyindicator.Thecandidateplantsshowingthebest quality parameters without any visible signs of viral disease were chosen to be tested at first by ELISA and PCR and then on woody indicators. Any plants found to be infectedwereremovedfromthecertificationprocess.Asaresult,atotalof1598virus free fruittreesweretestedonwoodyindicators.Atotalof140appletreesweretested, usingVirginiaCrab,GoldenDelicious,LordLambourne,R12(orMalus platycarpa) and SPY 227 indicators (EPPO 2001a). A total of 21 varieties of virus free apple trees were obtained. A total of 58 pear trees were tested, using Pyronia veitchii and Beurré Hardy indicators (EPPO 2001a). A total of 21 varieties of virus free pear trees were obtained.Atotal of 1295 plum plants were tested, using GF 305 indicator for plum fruit viruses and phytoplasma (EPPO 2001b). A total of 69 varieties of virus free plum trees were obtained. A total of 105 cherry trees were tested, using Bing,Sam,Canindex,ShirofugenandGF305indicators(EPPO2001c).Atotalof10 varietiesofvirus free cherrytreeswereobtained.Allthecertifiedfruittreesshouldbe free of agents mentioned in the certification schemes for apple, pear (EPPO 2001a), plum (EPPO 2001b) and cherry trees (EPPO 2001c). During testing and thanks to the reliability of woody indicators, the following diseases were diagnosed in the candidate plants: ACLSV, ApMV, ASGV, ASPV, apple proliferation, pear decline, PDV, PNRSV, PPV, ESFY, CNRMV. These candidate plants were eliminated from the certification scheme and replaced by healthy trees, or they were treated fot their diseases. Certification schemes allow production of the highest quality plant material within the Czech Republic.

249