Экспрессия генов Патрушев

111

комплекса на терминаторе. Предполагается, что в этот момент происходит конформационное изменение молекулы Pol I, что ослабляет взаимодействие компонентов комплекса друг с другом (как это имеет место в случае РНКполимеразы E. coli на ρ-независимых терминаторах транскрипции). Окончательный распад комплекса и освобождение Pol I, а также синтезированной молекулы РНК происходит лишь в присутствии дополнительного фактора PTRF (polymerase and transcript release factor),

который контактирует как с Pol I, так и с TTF-I.

Функциональная роль фактора TTF-I не ограничивается лишь участием в терминации транскрипции. Один из терминаторов транскрипции рДНК, так называемый To, расположен за 170 п.о. перед точкой инициации транскрипции генов рРНК. Взаимодействующий с To фактор TTF-I сильно стимулирует транскрипцию генов рРНК, вызывая перестройку структуры хроматина в окрестностях соответствующего промотора. Об изменениях структуры хроматина во время транскрипции см. следующий раздел 2.1.4.

Хотя для каждой из форм РНК-полимераз обнаружен свой специфический белковый фактор, необходимый для правильного освобождения транскриптов из элонгирующих комплексов, этим не ограничиваются механизмы, обеспечивающие терминацию транскрипции у эукариот. Действительно, одним из основных факторов терминации транскрипции у этой группы организмов является сложный белковый комплекс, обеспечивающий процессинг 3’-концевых последовательностей у предшественников мРНК, синтезируемых РНК-полимеразой II (см. ниже). В этом случае терминация транскрипции тесно сопряжена с процессингом премРНК пока неизвестным молекулярным механизмом.

Терминация транскрипции митохондриальных ДНК человека, так же как и терминация синтеза рРНК, требует участия специального белкового фактора. В этом случае фактор MTTERM может ускорять терминацию транскрипции in vivo митохондриальной РНК-полимеразой, а также ферментами бактериального и фагового происхождения. В отличие от терминаторов генов рРНК, митохондриальные сигналы терминации транскрипции в комплексе с фактором MTTERM распознаются молекулами РНК-полимераз в обеих ориентациях, что делает возможной терминацию транскрипции на H- и L-цепях мтДНК. Вследствие этого один общий терминатор может обеспечивать

112

сбалансированное образование продуктов транскрипции с обоих противоположно направленных митохондриальных промоторов.

2.1.4.Хроматин во время транскрипции

Вэукариотических клетках матрицей для РНК-полимераз служит ДНК, находящаяся в составе хроматина. Из общих соображений белки нуклеосом и более высокоорганизованного хроматина должны быть препятствием для образования инициационного комплекса и перемещения транскрипционного комплекса вдоль такой матрицы. Однако in vivo эти препятствия в соответствующих условиях легко преодолеваются. Исследование транскрипции хроматина в настоящее время еще далеко от своего завершения, а основные результаты получены в опытах in vitro. Тем не менее, в последнее время, благодаря взаимно дополняющим друг друга биохимическим и генетическим данным, становятся более ясными основные механизмы, обеспечивающие этот повсеместно распространенный процесс. Результаты такого рода исследований показывают, что наличие нуклеосом предотвращает неспецифическую транскрипцию инактивированных генов и является одним из необходимых условий их правильной экспрессии. Рассмотрим ряд современных моделей, в которых делается попытка объяснения таких механизмов.

Нуклеосомы и инициация транскрипции. Результаты многочисленных биохимических и генетических экспериментов показывают, что присутствие нуклеосом в промоторных участках генов, как правило, ингибирует транскрипцию. В частности,, установлено, что пространственное расположение последовательностей нуклеотидов в двух витках ДНК, намотанной вокруг гистонового октамера нуклеосомы, несовместимо со сборкой стабильного инициационного комплекса. Следовательно, для образования функционально активного инициационного комплекса, в состав которого входят РНКполимераза и факторы транскрипции, необходимо локальное разрушение нуклеосомной структуры хроматина в окрестностях промотора и регуляторных элементов. При этом реализуются две стратегии: непрерывное существование участка ДНК в виде свободной от нуклеосом последовательности нуклеотидов

ииндуцированное разрушение нуклеосом. Первый механизм функционирует на промоторах конститутивно транскрибируемых эукариотических генов и

113

обеспечивается белковыми факторами, которые разрушают имеющуюся нуклеосомную структуру данного участка ДНК или препятствуют ее образованию. Описаны, по крайней мере, три способа осуществления этого механизма: 1) факторы транскрипции успевают взаимодействовать с реплицируемой ДНК до сборки нуклеосом; 2) факторы связываются с соответствующими участками ДНК, содержащими нуклеосомы, и их дестабилизируют; 3) специализированные белки разрушают нуклеосомную структуру в области промоторов неэкспрессирующихся генов. Все эти механизмы могут функционировать как по отдельности, так и в различных сочетаниях.

Вновь синтезируемая эукариотическая ДНК обладает повышенной чувствительностью к нуклеазам, что указывает на ее более "открытую" структуру по сравнению со структурой в сформированном хроматине интерфазных ядер. Это может отражать наличие промежуточных стадий в сборке нуклеосом или формировании структур хроматина более высокого порядка. Считается, что сборка нуклеосом в реплицирующейся ДНК происходит в два этапа. Вначале гистоны H3 и H4 доставляются к ДНК с помощью фактора сборки хроматина CAF-I (chromatin assembly factor I), состоящего из трех субъединиц с молекулярными массами 150, 60 и 50 кДа. Вновь синтезируемые гистоны H3 и H4 связываются первыми двумя субъединицами, из которых полипептид с молекулярной массой 150 кДа обладает сильно заряженным доменом, а другой содержит в своем составе WD-повтор (где W и D – аминокислоты Trp и Asn в соответствии с однобуквенным обозначением). На втором этапе к строящимся нуклеосомам добавляются гистоны H2A и H2B, что завершает формирование кóровых частиц нуклеосом. Исследования in vitro

показали, что тетрамеры H3/H4 не исключают взаимодействия факторов транскрипции с соответствующими участками ДНК, как это делают зрелые нуклеосомы. С другой стороны, нуклеоплазмин, связывающий димеры H2A/H2B, стимулирует взаимодействие различных факторов с нуклеосомами (например GAL4, USF или Sp1). Кроме того, незрелый хроматин характеризуется пониженным содержанием линкерного гистона H1, присутствие которого стабилизирует нуклеосомы и структуры хроматина высшего порядка.

Конкурентные отношения между активацией транскрипции и созреванием хроматина во время клеточного цикла были продемонстрированы in vivo для

114

дрожжевых генов, локализованных вблизи теломерных участков хромосом. У таких генов может иметь место мозаичный эффект положения (см. раздел 3.2.4). Например, транслокация гена Ura3 в область теломеры часто подавляет его транскрипцию, которая может быть возобновлена под действием белкатрансактиватора транскрипции Ppr1, но только в фазе G2/M клеточного цикла. Именно в это время происходит полное созревание вновь образуемого хроматина у большинства эукариотических организмов. Однажды установившись, активированное или репрессированное состояние гена вблизи теломерных участков хромосом поддерживается на протяжении многих клеточных делений. Эти эксперименты показывают, что во время сборки хроматина имеется возможность перепрограммирования компетентности генов в отношении транскрипции и регуляторная структура хроматина является наследуемой в ряду клеточных поколений.

Промоторы, активируемые через разрушение нуклеосомной структуры непосредственно факторами транскрипции, характерны для генов теплового шока дрозофилы. В поддержании открытой структуры ДНК в этом случае участвуют основные факторы транскрипции, а также GAGA-фактор, которые взаимодействуют с промотором в окрестностях TATA-бокса и точки инициации транскрипции. Такое взаимодействие обеспечивает открытое состояние вышерасположенного регуляторного элемента теплового шока. При индуцированном механизме разрушения нуклеосомной структуры ДНК в окрестностях промотора перед активацией гена нуклеосомы присутствуют как в вышерасположенных регуляторных последовательностях ДНК, так и в самом промоторе. Во время индукции транскрипции такого гена регуляторные факторы, связываясь с ДНК, прямо или косвенно вызывают разрушение нуклеосомной структуры соответствующих участков ДНК. Аналогичная стратегия активации промоторов реализуется также и в генах, регулируемых глюкокортикоидами. Для активации промоторов, структурированных в нуклеосомы, требуется несколько этапов. Вначале регуляторные факторы, структура которых более подробно обсуждается в разделе 3.2.2, взаимодействуют своими ДНК-связывающими доменами с соответствующей регуляторной последовательностью, расположенной выше промотора, что сопровождается вытеснением части или всех гистонов нуклеосом этой последовательности. Активирующие домены белковых факторов транскрипции

115

далее индуцируют освобождение гистонов с основного промотора, что сопровождается образованием инициационного комплекса с участием РНКполимеразы и основных факторов транскрипции. Сборка транскрипционного комплекса приводит к вытеснению еще одной порции гистонов с промотора.

Модификация структуры нуклеосом через ацетилирование гистонов. Рассмотренный пример показывает, что не только ДНКсвязывающие домены факторов транскрипции адаптируют структуру хроматина для нужд синтеза РНК, но и их активирующие домены участвуют в разрушении структуры нуклеосом, расположенных на ДНК вблизи мест связывания факторов. Активирующие домены таких факторов взаимодействуют не только с основными факторами транскрипции, такими как TFIID, но и с коактиваторами транскрипции, которые не входят в состав основного транскрипционного комплекса, хотя и обеспечивают его функциональную связь с удаленными регуляторными последовательностями энхансеров и сайленсеров (подробнее см. раздел 3.2.2). До недавнего времени оставалось совершенно непонятным, каким образом активирующие домены факторов транскрипции могут оказывать влияние на структуру близлежащего хроматина. Этот вопрос начал проясняться после недавнего клонирования генов ядерных и цитоплазматических ацетилаз гистонов (HAT – histone acetyltransferase) и изучения свойств этих ферментов в очищенном состоянии.

Ацетилирование гистонов происходит на посттрансляционном уровне по специфическим остаткам Lys в N-концевых частях их полипептидных цепей, которые расположены на поверхности нуклеосомных частиц (см. табл. I.2). Эта посттрансляционная модификация уменьшает суммарный положительный заряд кóровых частиц нуклеосом и ослабляет взаимодействие плеч гистонов с ДНК. Хотя при этом сохраняется общая структурная целостность нуклеосом, их конформация может изменяться, что ингибирует in vitro зависимое от ионной силы образование структур хроматина более высокого порядка, связанное с подавлением транскрипции. Кроме того, ацетилирование гистонов нарушает специфические взаимодействия между их плечами и некоторыми регуляторными белками-репрессорами. В соответствии с этим, уже давно была обнаружена корреляция между повышенным уровнем ацетилирования гистонов и усилением транскрипции определенных участков генома, а пониженный уровень ацетилирования гистонов был связан с молчащими генами и

116

гетерохроматином. Однако оставался непонятным механизм избирательного ацетилирования гистонов на промоторах активируемых генов.

Ацетилазы гистонов эукариот разделяют на две основные группы – HAT A и HAT B. Для ацетилаз HAT A характерна ядерная локализация. Эта группа ферментов участвует в посттрансляционном ацетилировании гистонов кóровых частиц нуклеосом и оказывает прямое влияние на транскрипцию. Цитоплазматические ацетилазы HAT B преимущественно модифицируют молекулы гистонов, находящиеся в свободном состоянии, и участвуют в их доставке к реплицируемой ДНК. Для этих двух систем ацетилирования характерна разная субстратная специфичность. Если ацетилазы HAT A ацетилируют все четыре гистона кóровых частиц нуклеосом, то ацетилазы

HAT B модифицируют, прежде всего, гистоны H3 и H4 по другим остаткам Lys. Дрожжевая цитоплазматическая ацетилаза гистонов типа В, кодируемая геном HAT1, по-видимому, обеспечивает направленную доставку вновь синтезированных гистонов в ядра, где характер их ацетилирования может быть изменен ядерной ацетилазой HAT A. Последовательность нуклеотидов клонированного гена ацетилазы HAT A Tetrahymena неожиданно оказалась высокогомологичной последовательности гена известного коактиватора транскрипции дрожжей GCN5, продукт которого (Gcn5), как выяснилось, также обладает активностью ацетилазы гистонов. Эта находка явилась первым указанием на то, что ацетилирование гистонов может быть одной из причин, а не следствием активации генов. Белок Gcn5 образует тримерный комплекс с двумя другими белками – Ada2 и Ada3, которые необходимы для активации генов кислыми факторами транскрипции Gal4–Vр16 и Gen4. При этом комплекс Gcn5–Ada2–Ada3 образует прямые контакты и с транс-действующими, и с основными факторами транскрипции в составе транскрипционного комплекса. Это позволяет объяснить механизм направленной доставки ацетилазы гистонов к активируемому промотору соответствующими специфическими белок-белковыми взаимодействиями. Интересной находкой этой серии экспериментов явилось понимание двойной роли комплекса Gcn5–Ada в активации транскрипции. Во-первых, он ацетилирует гистоны нуклеосом промотора, что повышает его доступность для основных факторов транскрипции и других регуляторных белков. Во-вторых, он непосредственно контактирует с этими факторами, облегчая образование прединициационного

117

комплекса и стабилизируя его.

Таким образом, индивидуальные факторы транскрипции могут выполнять несколько разных функций в регуляции синтеза РНК, определяемых их выраженной доменной структурой. Как уже упоминалось, для полипептидных цепей большинства факторов транскрипции характерно наличие, по крайней мере, ДНК-связывающего и активирующего доменов. Из вышеизложенного следует, что ДНК-связывающие домены этих белков могут непосредственно изменять структуру нуклеосом в окрестностях промоторов, а активирующие домены не только контактируют с основными факторами транскрипции и стабилизируют их связь с промоторами, но и ассоциированы с активностями, модифицирующими структуру хроматина, что необходимо для эффективной инициации транскрипции и освобождения промотора элонгирующим транскрипционным комплексом. И все эти активности у дрожжей присущи одному сравнительно небольшому белковому комплексу Gcn5–Ada.

Деацетилазы гистонов. Стационарный уровень ацетилирования гистонов хроматина поддерживается в результате координированного действия HAT и деацетилаз гистонов (histone deacetylase – Hd), наиболее изученными из которых являются деацетилазы гистонов дрожжей, дрозофилы и человека. Быстрая очистка деацетилаз достигается с помощью аффинной хроматографии, в которой используется в качестве лиганда иммобилизованный высокоаффинный ингибитор трапоксин. При этом деацетилазы гистонов дрожжей выделяются в виде двух высокомолекулярных комплексов - HdA (350 кДа) и HdB (600 кДа). HdA может деацетилировать все четыре гистона и сильно ингибируется трихостатином А, тогда как HdB в 10 раз менее чувствительна к действию этого ингибитора. Очищенная HdA содержит в своем составе четыре полипептида, два из которых с молекулярными массами 75 и 71 кДа кодируются генами HDA1 и HDA3 соответственно. Деацетилаза HdB содержит в своем составе белок Rpd3, функционирование которого, как это было показано генетическими методами, необходимо для достижения не только полного подавления, но и полной активации экспрессии большого числа генов. В состав деацетилазы HdA входит Rpd3-подобный белок; такие белки представлены у дрожжей целым семейством, насчитывающим, по крайней мере, четыре члена. Инактивация деацетилаз HdA и HdB с помощью делеций в соответствующих генах приводит к гиперацетилированию гистонов H3 и H4 in vivo.

118

Как уже упоминалось, гиперацетилирование гистонов, как правило, коррелирует с активацией транскрипции определенных генетических локусов. Однако повышенный уровень ацетилирования гистонов может сопровождаться подавлением экспрессии генов, локализованных в теломерных участках хромосом дрожжей. Аналогичную ситуацию наблюдали у дрозофилы: инактивация гомологичного гена деацетилазы приводила к усилению эффекта положения гена white, транслоцированного в область центромерного гетерохроматина. Эти странные эффекты могут быть связаны с нарушением специфичности ацетилирования гистонов в условиях их гиперацетилирования при инактивации генов деацетилаз. Действительно, для подавления транскрипции у дрожжей необходимо ацетилирование единственного аминокислотного остатка (Lys-12 в гистоне H4). Кроме того, те же гистоны, ацетилированные по тому же самому положению, были обнаружены в транскрипционно неактивном β-гетерохроматине политенных хромосом дрозофилы.

Как и в случае ацетилаз гистонов, специфический характер действия деацетилаз обеспечивается путем образования комплексов с белкамирепрессорами и корепрессорами, которые распознают конкретные последовательности ДНК и друг друга. Ядерные рецепторы тиреоидных гормонов особенно хорошо иллюстрируют функционирование такого механизма. В отсутствие лиганда они взаимодействуют с комплексом репрессор–деацетилаза, что приводит к подавлению транскрипции соответствующих генов, тогда как под действием гормона рецепторы приобретают способность образовывать комплекс с коактиватором транскрипции и ацетилазой и стимулировать синтез РНК.

Другие специализированные белки, изменяющие структуру хроматина. В дополнение к вышеупомянутым белкам в настоящее время выделены и охарактеризованы два других специфических белковых комплекса, обеспечивающих изменение структуры нуклеосом во время транскрипции. Комплекс Swi/Snf был впервые обнаружен в клетках дрожжей генетическими методами как позитивный регулятор транскрипции большого числа генов, экспрессия которых контролируется разными механизмами. Похожий по механизму действия комплекс NURF (nucleosome remodeling

119

Таблица I.6

Субъединичный состав и свойства белковых комплексов

Swi/Snf и NURF

120

factor) был выделен из эмбрионов дрозофилы (табл. I.6).

Оба комплекса состоят из нескольких субъединиц, обладают ATPазной активностью и оказывают влияние на контакты между гистонами и ДНК. Однако для этих комплексов характерно отсутствие общих компонентов, и они различаются по механизмам стимуляции ATPаз. Такие различия между комплексами позволяют предполагать, что они действуют на разные субстраты и могут функционировать независимо друг от друга.

Первые указания на то, что факторы Swi/Snf участвуют в изменении структуры хроматина, были получены генетическими методами. Индивидуальные мутации SWI или SNF, ингибирующие экспрессию ряда генов, супрессировались мутациями, повышающими внутриклеточный уровень гистонов. Комплексы Swi/Snf, выделенные из клеток дрожжей и человека, содержали, по крайней мере, десять различных белков. Первые шесть компонентов, перечисленные в табл. I.6, были идентифицированы как продукты конкретных генов, тогда как другие (p78–p25) – только как полипептиды указанной молекулярной массы. Комплекс Swi/Snf стимулирует in vitro ATPзависимое связывание нуклеосомами транс-действующих факторов транскрипции. Мутационные изменения консервативных участков гистонов H3 и H4, необходимых для формирования у них правильной пространственной структуры, делают транскрипцию независимой от фактора Swi/Snf in vivo.

Недавно комплекс Swi/Snf удалось выделить в составе холофермента РНК-полимеразы II, так что этот комплекс может оказаться неотъемлемой частью транскрибирующего фермента и присутствовать в инициационных комплексах всех промоторов. Однако в таком случае остается не совсем понятным, почему мутации в генах SWI/SNF оказывают влияние на экспрессию лишь некоторых генов. Поскольку белки Swi/Snf ассоциированы с медиаторным комплексом, который, в свою очередь, связан с CTD-доменом РНКполимеразы II и обеспечивает ответ РНК-полимеразы на действие регуляторных факторов, последние могут по-разному реагировать на присутствие в комплексе мутантных белков Swi/Snf, что и может быть причиной дифференциального ответа конкретных промоторов на мутации.

Белковый комплекс NURF впервые был описан как кофактор уже упоминавшегося выше фактора транскрипции GAGA, который необходим для активации промотора гена теплового шока дрозофилы hsp70. In vivo в этом