2.7. Гемолитические анемии

• Анемии вследствие усиленного разрушения эритроцитов (гемолитические анемии):

• Анемии, обусловленные внеэритроцитарными факторами:

  • Иммунные гемолитические анемии:

    • изоиммунные гемолитические анемии;

    • аутоиммунные гемолитические анемии

  • Гемолитические анемии, обусловленные механическим повреждением эритроцитов

• Анемии, обусловленные эритроцитарными факторами:

  • Гемолитические анемии, связанные с нарушением структуры мембраны эритроцитов (эритроцитопатии - наследственные и приобретенные):

    • микросфероцитарная гемолитическая анемия;

    • овалоцитарная гемолитическая анемия;

    • стоматоцитарная гемолитическая анемия;

    • гемолитические анемии, обусловленные нарушением структуры липидов мембраны эритроцитов (акантоцитоз)

  • Гемолитические анемии, обусловленные дефицитом ферментов эритроцитов (эритроцитарные энзимопатии):

    • гемолитические анемии, связанные с недостаточностью активности ферментов гликолиза;

    • гемолитические анемии, связанные с недостаточностью активности ферментов пентозофосфатного шунта;

    • гемолитические анемии, связанные с недостаточностью активности ферментов глютатионовой системы.

• Гемолитические анемии, связанные с нарушенным синтезом глобина (гемоглобинопатии):

  • талассемии;

  • гемолитические анемии, обусловленные носительством аномальных гемоглобинов (НbS, НbС, НbD, НbЕ и др.);

  • гемолитические анемии, обусловленные носительством аномальных нестабильных гемоглобинов

• Гемолитическая анемия, обусловленная соматической мутацией клеток-предшественников миелопоэза:

  • пароксизмальная ночная гемоглобинурия

Характерно:

• Анемия

• Лейкоцитоз (нейтрофилез)

• Ретикулоцитоз

• Гипербилирубинемия (за счет непрямого билирубина)

2.8. Современная лабораторная диагностика лейкозов (иммунофенотипирование лейкозов)

• Лабораторная диагностика ОЛ начинается с выявления в периферической крови, костном мозге, и, реже, спинномозговой жидкости бластных клеток, которые идентифицируются методом световой микроскопии.

• Подробное морфологическое и цитохимическое описание разных типов бластов в настоящее время обязательно присутствует в каждом руководстве по онкогематологии, но фактически требует от патолога значительного опыта и далеко не всегда дает однозначную оценку бластов.

• Детально разработанная в конце 70-х годов (1976-1980) гематологами и патологами Франции, США и Великобритании ФАБ-классификация (France-America-Britain) разделила острые лейкозы на лимфобластные и нелимфобластные (миелобластные).

• При оценке бластов миелоидного происхождения морфологические критерии ФАБ-классификации достаточно информативны, однако, для верификации бластов лимфоидного происхождения их применение признано нецелесообразным (ВОЗ, 2000).

• В настоящее время основой для диагностики гемобластозов (заболеваний, связанных с пролиферацией гемопоэтических клеток предшественников и клеток крови на разных стадиях дифференцировки) служит классификация ВОЗ 2000г.

• Задача дифференциальной диагностики лейкозов может быть решена только путем изучения иммунологической характеристики клеток.

• Каждой стадии дифференцировки гемопоэтических клеток соответствует свой набор антигенов, которые по международной классификации называются дифференцировочными и разделяются на кластеры дифференцировки, обозначаемыеCD (cluster of differentiation).

• Революционное значение для диагностической иммунологии и гематологии оказала разработка методов получения моноклональных антител, что было подтверждено в 1984 присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине G. Kohler (Георг Кёлер) иS. Milstein (Сезар Мильштейн) вместе сN. Jerne (Нильс Ерне) за вклад в развитие теоретической иммунологии и биотехнологии.

• В 80-е годы прошлого века острый лейкоз рассматривался как блок дифференцировки клетки на определенной стадии ее развития, поэтому и варианты лимфобластных лейкозов получали свое название соответственно той стадии дифференцировки, антигены которой выявлялись на бластах в первую очередь.

• При неопластических изменениях блок дифференцировки может произойти на любой стадии нормального развития клеток, в результате чего образуется клон патологических клеток, определяющих субстрат болезни и имеющих одинаковую иммунологическую (или фенотипическую) характеристику.

• В настоящее время принято считать, что клональность происхождения не означает неизменности характеристик лейкозных бластов в течение болезни: антигенный дрейф, или изменение антигенной экспрессии в течение заболевания или в ответ на адекватную терапию является одним из отражений опухолевой прогрессии.

Иммунофенотипирование

• Метод определения типа клеток путем изучения молекул, присутствующих на их поверхности.

• На клетки воздействуют моноклональными антителами к определенному белку-антигену и оценивают реакцию их взаимодействия.

• При этом антитела несут флуоресцентную метку, а значит, «меченые» и «немеченые» клетки можно легко различить с использованием проточного цитометра.

• Фенотипирование позволяет с помощью моноклональных антител типировать бластные и зрелые клетки крови миело-, моно-, лимфоцитарного ряда по наличию дифференцировочных антигенов (рецепторов) в клеточной стенке.

Важные антигены

• CD2 - мономерный трансмембранный гликопротеид. Присутствует на поверхности всех циркулирующих в крови Т-лимфоцитов и на некоторых NK-лимфоцитах. CD2 принимает участие в процессе альтернативной активации Т-лимфоцитов. Фенотипирование острых Т-клеточных лейкозов, лимфом, хронических воспалительных и иммунодефицитных состояний.

• CD3 - белковый комплекс, ассоциированный с антиген-специфическим Т-клеточным рецептором, основной функциональный маркер Т-лимфоцитов. Способствует передаче сигнала активации с мембраны в цитоплазму клетки. Диагностика острых Т-клеточных лейкозов, лимфом (CD3 не экспрессируется при не-Т-клеточных лимфоидных новообразованиях) и иммунодефицитных заболеваний.

• CD4- трансмембранный гликопротеид, экспрессируемый субпопуляцией Т-хелперов (индукторов), составляющих 45% лимфоцитов периферической крови. На ранних стадиях развития лимфоцитов в тимусе, антигены CD4, так же как CD8, экспрессируется всеми кортикальными лимфоцитами. Медуллярные тимоциты, фенотип которых схож со зрелыми CD4+Т-клетками периферической крови (Т-хелперы), экспрессируют уже либо CD4, либо CD8 рецепторы. В периферической крови до 5% клеток несут одновременно антигены CD4 и CD8. Незначительная экспрессия CD4 возможна на некоторых клетках моноцитарного ряда. CD4 экспрессируется в большинстве случаев Т-клеточных лимфом, включая грибовидный микоз, а также при HTLV-ассоциированном Т-клеточном лейкозе (HTLV - human T-lymphotropic virus - Т-лимфотропный вирус человека).

• CD5- одноцепочечный гликопротеид, присутствующий на всех зрелых Т-лимфоцитах и большинстве тимоцитов, слабо экспрессируется В-лимфоцитами. CD5 выявляют на неопластических клетках В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза и центроцитарной лимфомы. При других типах злокачественных лимфоидных заболеваний - фолликулярной лимфоме, волосатоклеточном лейкозе, крупноклеточной лимфоме - CD5 не экспрессируется.э

• CD7- одноцепочечный белок, наиболее ранний маркер Т-клеточной дифференцировки. Он экспрессируется про-Т-лимфоцитами ещё до миграции их в тимус. CD7 выявляют на большинстве NK-клеток, слабая экспрессия отмечена на моноцитах. В-лимфоциты и гранулоциты не содержат этого антигена. Определение CD7 применяют в целях диагностики лимфом, детских Т-клеточных лимфобластных лейкозов.

• CD8- белок, состоящий из двух полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками. Экспрессируется субпопуляцией цитотоксических и супрессорных Т-лимфоцитов, которые составляют 20-35% лимфоцитов периферической крови. Этот антиген имеют также NK-лимфоциты, кортикальные тимоциты, 30% медуллярных тимоцитов и субпопуляции клеток красного костного мозга. CD8 исследуют для количественной оценки содержания Т-супрессоров.

• CD10 - ассоциированная с клеточной мембраной эндопептидаза. CD10 экспрессируют молодые формы В-лимфоцитов и субпопуляция кортикальных лимфоцитов. CD10 экспрессируют все клетки ОЛЛ.

• CD11сэкспрессируют на клеточной мембране макрофаги, моноциты, гранулоциты, NK-клетки и клетки волосатоклеточного лейкоза

• СD13- гликопротеид, экспрессируемый клетками миеломоноцитарного ряда (клетки-предшественники, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты и клетки миелоидных лейкозов). Он отсутствует на Т и В-лимфоцитах, эритроцитах и тромбоцитах.

• CD14- поверхностный мембранный гликопротеид. Экспрессируют в основном моноциты и макрофаги. CD14 определяют более чем на 95% моноцитах периферической крови и костного мозга. Сильную экспрессию CD14 наблюдают при острых миелобластных лейкозах. При острых и хронических лимфобластных лейкозах этот антиген не экспрессируется.

• CD15- олигосахарид. Он принимает участие в процессах фагоцитоза и хемотаксиса. Этот антиген присутствует на поверхности зрелых гранулоцитов и клетках Березовского-Штернберга. Экспрессию антигена CD15 выявляют при болезни Ходжкина. При неходжкинских лимфомах CD15 в большинстве случаев не обнаруживают.

• CD16 экспрессируется на поверхности гранулоцитов, моноцитов, макрофагов и NK-клеток. Все лимфоциты, экспрессирующие этот антиген, обладают способностью к антителозависимой клеточной цитотоксичности. CD16 определяют при типировании хронических миелоцитарных лейкозов, для характеристики NK-клеток.

• CD19- гликопротеин, присутствующий на всех периферических В-лимфоцитах, а также на всех предшественниках В-клеток. Отсутствует на плазматических клетках. Это самый ранний маркер В-клеток, играет важную роль в регуляции активации и пролиферации В-лимфоцитов. CD19 экспрессируется на всех неопластических клетках острых лейкозов В-клеточного происхождения, а также присутствует при некоторых формах острых монобластных лейкозов.

• CD20- негликозилированный белок. В онтогенезе В-лимфоцитов антиген CD20 появляется после CD19 на стадии пре-В-клеточной дифференцировки лимфоцитов. На плазматической мембране плазматических клеток он отсутствует. Экспрессируется при ОЛЛ, В-клеточных хронических лимфоцитарных лейкозах, волосатоклеточных лейкозах, лимфомах Беркитта и очень редко - при острых монобластных лейкозах.

• CD21- гликопротеид, в значительном количестве присутствует на В-лимфоцитах в лимфоидных органах и в небольшом количестве - на В-клетках периферической крови. CD21 - рецептор для вируса Эпштэйна-Барр.

• CD22- белок, состоящий из двух полипептидных цепей. Экспрессируется на мембране большинства В-лимфоцитов, включая клетки-предшественники (пролимфоциты). Антиген не экспрессируется на В-лимфоцитах (плазматические клетки) после их активации. Наиболее выраженную экспрессию CD22 выявляют на клетках при волосатоклеточном лейкозе, слабую - при миелоидных лейкозах и не-Т-клеточных ОЛЛ.

• CD23- гликопротеид, экспрессируемый активированными В-лимфоцитами периферической крови в гораздо большей степени. CD23 опосредует IgE-зависимую цитотоксичность и фагоцитоз макрофагами и эозинофилами.

• CD25 - одноцепочечный гликопротеид, идентифицированный как низкоаффинный рецептор к ИЛ-2. Экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и, с меньшей плотностью, на активированных В-клетках. В периферической крови здоровых людей антиген присутствует более чем на 5% лимфоидных клеток.

• CD29- рецептор фибронектина. Широко распространён в тканях, экспрессируется лейкоцитами. Определение CD29 на клетках периферической крови используют для типирования субпопуляции Т-клеток, имеющих фенотип CD4+CD29+, которые называют хелперами 2 типа (Th2). Эти клетки посредством продукции лимфокинов участвуют в реализации гуморального иммунного ответа.

• CD33- трансмембранный гликопротеид. Присутствует на поверхности клеток миелоидного и моноцитарного рядов. Его обнаруживают на поверхности моноцитов и, в меньшей степени, гранулоцитов периферической крови. Приблизительно 30% клеток красного костного мозга экспрессируют CD33, включая миелобласты, промиелоциты и миелоциты. Антиген отсутствует на мембранах полипотентных стволовых клеток. Определение CD33 используют для характеристики клеток при лейкозах миелоидного происхождения. Клетки лейкозов лимфоидного и эритроидного происхождения не экспрессируют CD33.

• CD34- фосфогликопротеин, экспрессируется гемопоэтическими клетками-предшественниками, включая монопотентные стволовые клетки. Наиболее выраженную экспрессию Аг наблюдают у ранних предшественников; при созревании клеток экспрессия маркёра падает. CD34 обнаружен также на эндотелиальных клетках. Определение CD34 используют для характеристики клеток при острых миело- и лимфобластных лейкозах. При хронических лимфоцитарных лейкозах и лимфомах экспрессии антигена CD34 не выявляют.

• CD41аэкспрессируется тромбоцитами и мегакариоцитами. Моноклональные антитела для выявления CD41а используют для диагностики мегакариобластного лейкоза. При тромбастении Глянцманна экспрессия этого антигена отсутствует или значительно подавлена.

• CD42b - мембранный гликопротеид, состоящий из двух полипептидных цепей. Антиген выявляют на поверхности тромбоцитов и мегакариоцитов. В клинической практике обнаружение CD42b используют для диагностики тромбоцитопатии - синдрома Бернара-Сулье.

• CD45RA принадлежит к классу трансмембранных гликопротеинов. Это общий лейкоцитарный антиген. Экспрессируется на клеточной мембране В-лимфоцитов, в меньшей степени Т-лимфоцитов и на зрелых медуллярных тимоцитах. Маркёр не экспрессируется гранулоцитами.

• CD45RО - низкомолекулярная изоформа CD45RA - общего лейкоцитарного Аг. Выявляют на Т-клетках (Т-лимфоциты памяти), субпопуляции В-лимфоцитов, моноцитах и макрофагах. Моноклональные АТ к CD45RО взаимодействуют с большинством тимоцитов, субпопуляцией покоящихся CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов и зрелыми активированными Т-клетками. Клетки миеломоноцитарного происхождения, гранулоциты и моноциты также несут этот антиген. Его выявляют при центробластных и иммунобластных лимфомах.

• CD46- О-гликозилированный димер. Он широко распространён в тканях и экспрессируется Т- и В-лимфоцитами, моноцитами, гранулоцитами NK-клетками, тромбоцитами, эндотелиальными клетками, фибробластами, но отсутствует на поверхности эритроцитов. CD46 обеспечивает защиту тканей от действия комплемента.

• CD61- тромбоцитарный антиген. Экспрессируется на тромбоцитах периферической крови и красного костного мозга, а также на мегакариоцитах и мегакариобластах. Его определение используют в качестве маркёра при острых мегакариобластных лейкозах. Экспрессия антигена отсутствует или подавлена у больных с тромбастенией Гланцманна.

• CD95, называемый такжеFasилиAPO-1, - трансмембранный гликопротеин, член семейства рецепторов фактора некроза опухолей. Он экспрессируется в значительных количествах на Т-лимфоцитах (CD4+ и CD8+) периферической крови и, в меньшей степени, на В-лимфоцитах и NК-клетках. Этот антиген экспрессируется также на гранулоцитах, моноцитах, клетках тканей и неопластических клетках. Связывание CD95 сFas-лигандом(CD95L), индуцирует в клетках апоптоз.

• CD95L, илиFas-лиганд, мембранный белок, относящийся к семейству рецепторов фактора некроза опухолей. Этот антиген экспрессируется цитотоксическими Т-лимфоцитами, NК-клетками и очень часто опухолевыми клетками; основной индуктор апоптоза в клетках.

• HLA-DR - мономорфная детерминанта молекул II класса главного комплекса гистосовместимости человека (HLA). Маркёр экспрессируется на клетках Лангерганса, дендритных клетках лимфоидных органов, определённых типах макрофагов, В-лимфоцитах, активированных Т-клетках и эпителиальных клетках тимуса. Исследование на данный маркёр используют для количественного определения активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+ HLA-DR+.

• Используя различный подбор моноклональных антител к маркёрам, можно составить фенотипический портрет клеток, характерных для данной формы лейкоза.

• Помимо использования методов иммунофенотипирования для диагностики и дифференциальной диагностики гемобластозов, особенно важным оказалось их применение в процессе лечения для оценки состояния ремиссии и остаточной популяции лейкозных клеток. Зная фенотипический «портрет» бластных клеток в период установления диагноза, по этим маркёрам удаётся обнаружить клетки лейкозного клона в период ремиссии, а по нарастанию их количества - предсказать развитие рецидива задолго (за 1-4 мес) до появления его клинико-морфологических признаков.