Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Патогенные анаэробы рода Clostridium в ветеринарной медицине. Учебное пособие для студентов ветеринарного факультета.pdf
71
Для выявления токсина необходима биологическая проба на белых
мышах. С этой целью отбирают 100 см
3
жидкого продукта или экстракта,
полученного с физиологическим раствором (водой) из продуктов плотной
консистенции.
Из плотного продукта исходную жидкость получают следующим
образом. Продукт предварительно измельчают ножом или ножницами,
переносят в стерильную ступку и растирают до однородной консистенции,
постоянно добавляя воду или физиологический раствор до соотношения 1:1
или 1:2. Полученные смеси выдерживают при 4±2°С в течение 2 ч. Затем
отделяют жидкую фракцию отстаиванием или фильтрованием через ватномарлевый фильтр, не адсорбирующий ботулинистические токсины, либо
центрифугируют при температуре 4±2°С и частоте вращения 3000 об./мин в
течение 15—20 мин.
Исходную жидкость переносят в две пробирки пипеткой с резиновой
грушей по 2—3 см
3
; в третью пробирку вносят 2,7 см3 жидкости и 0,3 см3
раствора трипсина или панкреатина, устанавливают рН 6+1. Содержимое
первой пробирки оставляют без обработки, второй — кипятят на водяной
бане 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Третью пробирку (с
ферментом) термостатируют при 37 °С в течение 1 ч, периодически
перемешивая содержимое. Обработка протеолитическим ферментом
необходима для выявления протоксина CI. botulinum, активизирующегося
под действием трипсина. Биологическую пробу ставят непосредственно
после окончания обработки исходной жидкости протеолитическим
ферментом.
Фильтрат из каждой пробирки вводят двум белым мышам массой 16—
18 г внутривенно или внутрибрюшинно в дозе 0,5 см
3
. При наличии
ботулинистического токсина животные, зараженные непрогретым
фильтратом (из 2-й и 3-й пробирки) или только фильтратом, обработанным
трипсином (из 3-й пробирки), заболевают и погибают в течение 2—5 сут, а
иногда даже в течение первых 4—12 часов с характерной клинической
72
картиной ботулизма. Шерсть у мышей взъерошена, дыхание затруднено,
мышцы брюшной стенки ослаблены и западают («осиная талия»),
наблюдаются судороги, паралич задних конечностей и смерть. При очень
высокой концентрации токсина гибель животных может наступить в течение
1—2 ч без характерных признаков ботулизма; в этих случаях биопробу
повторяют с разведением исходной жидкости 1:10—1:100. Мыши, которым
введена исходная жидкость без трипсина, могут переболеть и остаться
живыми или погибнуть позже.
Тип ботулинистического токсина определяют в реакции нейтрализации
токсина (РН). Вначале ставят РН со смесью противо- ботулинистических
сывороток. Смешивают равные объемы моновалентных сывороток типов А,
В, С, Е, F и 0,6 см
3
полученной смеси добавляют в пробирку к 2,4 см3
исследуемого фильтрата. В другую (контрольную) пробирку к 2,4 см
исследуемого фильтрата добавляют 0,6 см
3
физиологического раствора.
Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают в течение 30 мин при
комнатной температуре. Для биологической пробы анализируемый фильтрат
(центрифугат) вначале отбирают из контрольной, а затем из опытной
3
пробирки по 1 см
вводят двум белым мышам. Наблюдение за животными
ведут на протяжении 2, 4, 6, 24 ч и в течение 4 сут. У мышей, которым
вводили смешанный с сывороткой фильтрат (центрифугат), признаков
заболевания ботулизмом не наблюдается.
Затем ставят развернутую РН с моновалентными,
типоспецифическими, антитоксическими, диагностическими сыворотками.
Для этого в шесть пробирок разливают по 2,4 см
3
фильтрата. Затем в пять из
3
3
них добавляют по 0,6 см
3
физиологического раствора (контроль). Приготовленную смесь
см
сыворотки типов А, В, С, Е, F, а в шестую — 0,6
выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего
вводят по 1 см
3
каждой смеси внутрибрюшинно двум мышам. Для взятия
пробы из каждой пробирки используют чистый шприц. Результаты
учитывают в течение 4-х суток через каждые 4—6 ч, затем — через 24 ч.
73
Мыши, которым была введена смесь токсина и гомологичной сыворотки,
выживают, остальные погибают.
Если необходимо выделить культуру токсигенных штаммов CI.
botulinum, производят посев из продукта на специальные плотные
питательные среды с последующим определением морфологических и
биохимических признаков, характерных для CI. botulinum. При подозрении
на присутствие вегетативных клеток CI. botulinum для посева, согласно ГОСТ
10444.7—86, используют печеночно-глицериновую, улучшенную
клостридиальную среду, бульон с кониной и мальтозой, а также среду Китта
-Тароцци — без предварительной обработки. Для выявления в продукте спор
CI. botulinum используют те же среды, прогревая посевы при 80+1 "С в
течение 15 мин.
При подозрении на присутствие спор CI. botulinum типов А, В, С, D, F,
не разлагающих казеин, применяют также триптозопептонно- глюкозную
среду с дрожжевым экстрактом и среду Хоттингера.
Навески продукта вносят на самое дно пробирки с питательной средой.
Одну из навесок перед посевом смешивают с равным объемом 96%-го
этанола в колбе с притертой пробкой, периодически встряхивая,
выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем вносят в
питательную среду.
Посевы термостатируют до 14 сут; после появления признаков роста
выдерживают в термостате еще 5 сут, затем переносят в холодильник и
хранят при 4±2°С.
Морфологические и культурально-биохимические особенности CI.
Botulinum изучают непосредственно после обнаружения признаков роста в
питательных средах, а затем на 3-й и 5-е сутки последующего
культивирования. С этой целью со дна пробирки отбирают пастеровской
пипеткой культуральную жидкость, готовят мазки. Окрашивают их по Граму
и на споры, определяют подвижность, ставят реакцию на каталазу (CI.
botulinum каталазоотрицательны).
74
Одновременно проводят пересев пастеровской пипеткой (посев частым
штрихом с площадкой или по секторам по Дригальскому) на плотные
питательные среды для выделения чистой культуры. В ГОСТ 10444.7—86
рекомендованы специальные среды: печеночно- желточный агар и глюкозокровяной агар. Предварительно создав анаэробные условия, посевы
помещают в термостат на 48 ч при температуре от 30 до 36 °С.
На поверхности плотных сред CI. botulinum образует прозрачные,
выпуклые или плоские, немного расплывчатые колонии неправильной
формы с ровными или изрезанными краями (см. выше). На печеночножелточном агаре колонии окружены «жемчужной» зоной лецитиназной
активности, которая повторяет их контур. На сахарном кровяном агаре
колонии (кроме типа G) окружены зоной бета-гемолиза.
Для дальнейшего изучения отбирают 5—10 колоний с характерными
свойствами. Колонии эмульгируют в физиологическом растворе и
пересевают на желатин-лактозную среду (или МПЖ), полужидкие среды
Гисса с глюкозой (разлитые высоким столбиком) с глюкозой, лактозой,
маннитом, мальтозой, сахарозой, салицином, на среду с калия нитратом и на
бульон Хоттингера с закрепленной под пробкой индикаторной бумажкой на
сероводород. Культивируют в анаэробных условиях при 30—36 °С. Учет
проводят через 24—48 ч.
К виду Cl. botulinum относят микроорганизмы, если они не
ферментирует лактозу, сахарозу, маннит, способность сбраживать глюкозу,
мальтозу и салицин варьирует, разжижают желатин, нитраты не
восстанавливают, индол не образуют, выделяет сероводород.
Результаты исследования на способность культуры образовывать
ботулинистический токсин оценивают по биопробе, аналогичной вышеописанной (с фильтратом суспензии навески продукта).
При обнаружении клостридий и ботулинистического токсина или
протоксина в культуральной жидкости посева навески продукта считают, что
в продукте присутствует токсигенный штамм CI. botulinum. При выявлении в
75
посевах даже одной колонии клостридий, способной образовывать
ботулинистический токсин или протоксин, считают, что в продукте
содержится токсигенный штамм CI. botulinum.
Этапы выявления сульфитредуцирующих клостридий из пищевых продуктов
К сульфитредуцирующим клостридиям относят сульфитредуцирующие
грамположительные каталазоотрицательные, способные расти в анаэробных
условиях и не способные расти в аэробных условиях микроорганизмы.
1-й этап исследования
Для выявления присутствия (отсутствия) сульфитредуцирующих
клостридий в определённом количестве исследуемого материала навеску
пробы или эквивалентное разведение вносят в пробирку и осторожно
заливают одной из вязких питательных сред:
■ Вязкая среда Вильсона-Блера;
■ или вязкая железосульфитная среда;
■ или вязкая дифференциальная улучшенная клостридиальная
среда.
Соотношение между количеством посевного материала и питательной
средой должно составлять 1:9. Посевы культивируют при 37—38 °С (в
некоторых случаях при 44 °С) 48—72 ч. Ежедневно просматривают посевы и
отбирают пробирки с признаками роста, то есть с наличием отдельных
чёрных колоний или полностью почерневшей питательной среды на глубине
не более 1 см.
2-й этап исследования
Из положительных посевов пересевают культуры истощающим
штрихом на поверхность одной из плотных селективно- диагностических
сред в чашках Петри. Для выявления сульфитредуцирующих клостридий
предложены:
■ Агаризованная среда Вильсона-Блера;
76
■ или триптозо-сульфит циклосериновый агар;
■ или плотная дифференциальная улучшенная клостридиальная
среда;
Посевы инкубируют в анаэробных условиях при 37—38 °С (в
некоторых случаях при 44 °С) в течение 24—48 ч.
Отмечают появление характерных колоний — черных, овальных и
окружённых чёрным или серым ореолом диаметром 4—5 мм.
Для дальнейшего изучения отбирают не менее 5 характерных колоний,
которые пересевают в свежерегенерированную (т.е. прогретую на водяной
бане при 80 °С 10 мин) среду Китта-Тароцци.
3-й этап исследования
Полученные культуры используют для подтверждения
принадлежности выделенных сульфитредуцирующих микроорганизмов к
роду Clostridium. Для этого из каждой полученной культуры готовят по 2
мазка. Один мазок окрашивают по Граму, второй — для определения
эндоспоры. Сульфитредуцирующие клостридии представляют собой
короткие толстые грамположительные палочки с закруглёнными концами. В
мазках они расположены одиночно, попарно, в виде цепочек или
штакетообразных (параллельно друг другу) скоплений. Образуют круглые
или овальные эндоспоры, расположенные чаще всего субтерминально. У
культур определяют наличие каталазы и проводят подтверждение
анаэробного роста.
• Для определения каталазной активности используют культуры не
старше 24 ч. 1—2 капли нейтрализованной культу- ральной жидкости
помещают обезжиренной пипеткой на профламбированное и охлаждённое до
комнатной температуры предметное стекло, а затем наносят на неё пипеткой
каплю 3% раствора перекиси водорода. Если через 30—60 с на стекле
появляются пузырьки газа, то считают, что микроорганизмы образуют
каталазу. Сульфитредуцирующие клостридии каталазу не образуют.
77
■ Для подтверждения анаэробного роста анализируемые культуры
пересевают на одну из вышеперечисленных сред в чашки Петри под стекло
или в трубки Вейона. Посевы инкубируют в анаэробных в анаэробных
условиях при 37—38°С в течение 18—72 ч. Для сульфитредуцирующих
клостридий характерен анаэробный рост.
Определение количества сульфитредуцирующих клостридий
методом посева в агаризованную среду
Для выявления характерных колоний по 1 см
3
подготовленной пробы
или разведения вносят параллельно в две пустых стерильных чашки Петри.
Посевы заливают 15—20 см
3
расплавленной и охлаждённой до 40—45 °С
элективной среды для сульфитредуцирующих клостридий. ГОСТ 10444.9-88
предусмотрено использование для этой цели:
■ агара Вильсона-Блера;
■ или плотной дифференциальной улучшенной клостридиальной
среды;
■ или триптозо-сульфит-циклосеринового агара.
Содержимое чашек Петри быстро перемешивают осторожными
круговыми движениями. После застывания среды чашки подсушивают и
заливают той же средой или голодным агаром так, чтобы высота второго
слоя агаризованной среды была не менее 4 мм (то есть вносят дополнительно
по 10 см
3
среды). Чашки с посевами после застывания среды переворачивают
и термостатируют при температуре 37°С (в некоторых случаях при 44 °С) в
течение 24—72 ч в анаэростатах с разряжением 0,6—0,8 атм, в анаэробных
условиях, созданных химическим способом или под стеклом.
После окончания термостатирования отбирают те чашки, на которых
выросло от 15 до 150 характерных колоний и подсчитывают их количество. В
триптозо-сульфит-циклосериновом агаре, сульфит- полимиксиннеомициновом агаре или среде Вильсона-Блера колонии
сульфитредуцирующих клостридий черного цвета различной интенсивности
окраски, имеют форму двояковыпуклой линзы, комочка ваты или
78
«самолетика». На среде сахарно-кровяной агар Цейсслера образуются
колонии, зеленеющие на воздухе и окруженные одной или двумя зонами
гемолиза. Отбирают не менее 5 таких колоний и подтверждают их
принадлежность к сульфитредуцирующим клостридиям, как описано в
предыдущем разделе. Если подтверждается, что из выбранных пяти колоний
не менее 4-х можно отнести к сульфитредуцирующим клостридиям, то
считают, что все характерные колонии на чашке Петри являются колониями
сульфитредуцирующих клостридий. В остальных случаях количество
сульфитредуцирующих клостридий определяют, исходя из процентного
отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных
колоний, взятых для подтверждения.
Если при санитарно-микробиологических исследованиях требуется не
только выявить сульфитредуцирующие клостридии, но и идентифицировать
их до вида — Clostrisium perfringens — необходимо более углублённое
тестирование полученных культур (при санитарно- микробиологических
исследованиях это требуется не всегда!)
79
Блок 3. Клостридии - патогенные анаэробы возбудители
заболеваний животных
К числу микроорганизмов, обладающих способностью вызывать
тяжело протекающие инфекционные или интоксикационные процессы у
животных и человека, относится группа патогенных анаэробов.
Клостридии - многочисленная группа почвенных анаэробных
бактерий, включающая 61 вид. Однако только 12 из них патогенные
микроорганизмы.
Экологической особенностью различных представителей рода
клостридий является их способность к сапрофитическому существованию,
высокая устойчивость к неблагоприятным воздействиям среды,
обеспечиваемая спорообразованием, и широкое их распространение
практически на всех континентах. Типичными местами их обитания и
размножения являются почва и желудочно-кишечный тракт животных.
Патогенные клостридий относятся к семейству бацилл (Васillасеа),
роду клостридий (Clostridium).
Важнейшими возбудителями анаэробных клостридиозов являются:
Cl.tetani, Cl.botulinum, Cl.chauvoei, Cl.perfringens, Cl.septicum, Cl.novyi,
Cl.histolyticum, Cl.sordellii.
3.1. ВОЗБУДИТЕЛЬ СТОЛБНЯКА
Возбудитель столбняка - Cl.tetani. Вызывает остропротскающую
неконтагиозную раневую инфекцию, при которой нервная система
поражается экзотоксином микроба.
Болезнь возникает в результате различных травм и ранений при
условии внесения в них спор возбудителя, что возможно при попадании
почвы, и сопровождается тоническими и клоническими сокращениями
мышц.
Возбудителя столбняка открыли: Н. Д. Монастырский в 1883 г. и в
1884 г. А. Николайер. Чистую культуру выделил в 1889 г. Китазато.
80
Морфология. Клостридий столбняка - крупные тонкие палочки с
закругленными концами длиной 3-12 и шириной 0,3-0,8 мкм. В препаратах
из пораженных тканей бактерии располагаются отдельно и группами по 2-3
клетки, из культур, особенно молодых, на жидких средах отмечаются
длинные изогнутые нити.
Столбнячная палочка подвижна (перитрих), может иметь до 20 и более
жгутиков; в старых культурах преобладают клетки без жгутиков. Капсулу не
синтезируют. Образует терминальные круглые споры, в 2-3 раза шире
клетки, в результате этого бактерия приобретает вид барабанной палочки
(рис.3).
Рис.3. Тонкие, стройные палочки до 6 мкм, спора округлая на конце микробной
клетки.
Споры формируются в культурах обычно через 2-3 сутки, они также
образуются и в организме. Палочки со спорами неподвижны (рис. 4). На 4-6е сутки культуры на жидких средах состоят исключительно из спор и почти
не содержат вегетативных клеток: они лизируются.
Вегетативные клетки хорошо окрашиваются спиртоводными
растворами анилиновых красок. Грамположитсльны, но в старых культурах
часть бактерий грамотрицательна. В окрашенных по Граму мазках из
молодых культур споры так же, как и палочки, прокрашиваются равномерно
в фиолетовый цвет, в препаратах из старых культур терминальные и
расположенные изолированно споры имеют вид колечек.