Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Патогенные анаэробы рода Clostridium в ветеринарной медицине. Учебное пособие для студентов ветеринарного факультета.pdf
61
содержание спор в продукте, был ответственен за вариации только в 7,4%
0
случаев. Наиболее ранний срок выявления токсичности продукта при 20
0
хранения — один день, а при 4
С хранения этот срок увеличивался до 18
С
дней. При инокуляции спор типа E в продукты из рубленого мяса и хранении
0
при 3
сельдь была инокулирована 10
вакуумных упаковках при 3,3
С не наблюдали роста в течение 170 дней. Однако в случае, когда
4
спор типа E на грамм и ее хранении
0
С, токсигенез был зарегистрирован на 21 день.
Природа ботулинических нейротоксинов
Нейротоксины, образующиеся в бактериях, высвобождаются в
результате автолиза. Они продуцируются клетками, растущими в
оптимальных условиях, хотя были сообщения о том, что покоящиеся клетки
также образуют токсины. Ботулинические нейротоксины (BoNT) являются
наиболее токсичными из всех известных веществ. Сила воздействия
очищенного токсина типа A, испытанного на мышах, оценивается в 30
миллионов LD 50 /мг. Как сообщалось, минимальной летальной дозой для
мышей является доза BoNT, составляющая 0,4–2,5 нг/кг при его
внутривенном или внутри перитонеальном введении, а 50% летальной дозы
для человека составляло около 1 нг/кг веса тела. В 1946 г. усилиями Lamann
и др., а также Abrams с соавт. первым из этих токсинов был выделен и
очищен токсин типа A. Позднее были выделены и очищены токсины,
принадлежащие к типам B, E и F.
Гены ботулинических нейротоксинов типов A, B, E и F имеют
хромосомную локализацию, тогда как токсин типа G — плазмидную.
Штаммы бактерий, продуцирующих токсины, относящиеся к кластеру типа
G, за исключением других ботулинических штаммов, входят в группу IV. Ген
BoNT типа B был клонирован и сиквенирован. BoNT продуцируются в виде
единой полипептидной цепи, которая посттрансляционно расщепляется и
образуются две цепи, состоящие из тяжелой цепи, весом в 100 кДа и легкой
цепи в 50 кДа, связанных между собой дисульфидными связями. Белок
состоит из трех доменов — связывающего, транслоцирующего и
62
каталитического. Связывающий домен был использован в качестве
иммуногена, который позволяет осуществлять защиту против
ботулинических нейротоксинов в опасных дозах. После связывания BoNT с
рецепторами нервных клеток они, по-видимому, интернализуются в
эндосомы, после чего происходит протеолитическое расщепление
синаптобревинов (белковых компонентов синаптических везикул), что, в
свою очередь, блокирует выделение нейротрансмиттеров.
Установлено, что токсин типа A гораздо более опасен, чем токсины
типов B или E. Показано, что токсин типа B вызывает летальные исходы в
значительно меньшем числе случаев, чем токсин типа A. При этом
выздоровления после отравления токсином типа B происходили даже в тех
случаях, когда в крови определяли значительные дозы этого токсина.
Симптомы ботулизма могут появляться при парентеральном или
пероральном введении токсинов. Они могут переходить в кровяной поток,
проникая через мембраны мукозных слоев дыхательных путей, а также через
стенки желудка и кишечника. Под воздействием протеолитических
ферментов желудка токсины не полностью инактивируются, и, безусловно,
те, которые продуцируются не протеолитическими штаммами, могут быть
активированы. Высокомолекулярные комплексы или предшественники
обладают большей устойчивостью к кислотам пепсина. После абсорбции
ботулинических токсинов в кровяное русло они проникают в
периферическую нервную систему.
Токсины ботулинических бактерий состоят из серии из семи связанных
токсинов, главный из которых обладает молекулярным весом в 150 кДа. Эти
токсины связываются с пресинаптическими терминальными мембранами в
нервно-мышечных соединениях, где они блокируют выделение
ацетилхолина. Это приводит к пассивному параличу, что является основой
косметического использования ботулинических токсинов (Botox). В отличие
от ботулинического токсина токсин столбняка блокирует нервный фактор,
позволяющий осуществлять мышечное расслабление, что в итоге приводит к
63
спастическому параличу. Ботулинические токсины отличаются от
стафилококковых токсинов и термостабильных токсинов других пищевых
патогенов своей чувствительностью к температуре. Они могут быть
0
разрушены нагреванием до 80
С от 10 минут или при кипячении в течение
нескольких минут.
Синдром ботулизма у взрослых людей: распространение и характерные
продукты питания.
Симптомы ботулизма могут появляться в период между 12 и 72 ч после
употребления содержащей токсин пищи. Более длительные инкубационные
периоды в практике неизвестны. Симптомы отравления включают появление
тошноты, рвоты, усталости, головокружения, головной боли, сухости
кожных покровов, полости рта и глотки, запоров, отсутствие лихорадки,
паралич мышц, раздвоение зрения, остановку дыхания и смерть. Заболевание
длится от одного до десяти более дней в зависимости от сопротивляемости
организма хозяина и других факторов. Уровень смертности варьирует в
пределах от 30 до 65%. Все симптомы отравлений вызываются действием
экзотоксина, и лечение состоит в возможно более срочном введении
специфической антисыворотки. Хотя и предполагается, что при
употреблении содержащей токсин пищи происходит абсорбция токсина в
ротовой полости, Lamannaс со авт. (1967) обнаружили, что мыши и обезьяны
гораздо более чувствительны к токсинам при введении их через трубку
непосредственно в желудок, чем при выдерживании во рту. Ботулинические
токсины являются нейротоксинами и необратимо прикрепляются к нервам.
Раннее лечение с использованием антисыворотки значительно улучшает
прогноз.
До 1963 г. большинство случаев ботулизма в США было вызвано
токсинами типов A и B, а характерной пищей, содержащей эти токсины,
были овощи домашнего консервирования. Почти в 70% из 640 случаев
отравлений, о которых сообщалось в период с1899 по 1967 г., не было
выявлено, какие именно продукты питания являлись источником заражения.
64
Из 640 случаев 17,8% были связаны с употреблением овощей, 4,1% — с
употреблением фруктов, 3,6% — с употреблением рыбы, 2,2% — с
употреблением приправ, 1,4% — с употреблением мяса, домашней птицы и
дичи 1,1%—всех других продуктов питания. Следующим по количеству
отравлений источником питания являлся острый соус домашнего
консервирования. До 1951 г. в Японии не было зарегистрировано вспышек
массовых отравлений. За период с мая 1951 г. по январь 1960 г. было
зарегистрировано 166 случаев отравлений, и среди них было 58 смертельных
исходов (уровень смертности, таким образом, равнялся 35%). Большинство
из этих вспышек массовых отравлений было вызвано употреблением
рыбного блюда домашнего приготовления, называемого «изуши». Это
консервированная пища, состоящая из сырой рыбы, овощей, вареного риса,
ферментированного риса и небольшого количества соли и уксуса.
Приготовленная пища плотно пакуется в деревянные бочонки, закрывается
крышкой и выдерживается в течение трех недель или более, пока происходит
молочнокислое брожение. В ходе этого процесса происходит снижение Eh
потенциала, что способствует росту анаэробов.
Несколько массовых вспышек заражений ботулизмом были вызваны
употреблением консервированными в закрытых банках грибами.
Исследования, проведенные в период с 1973 по 1974 г., показали, что 30
банок с консервированными грибами содержали ботулинические токсины (из
них 29 банок содержали токсин типа B). Кроме того, в 11 банках, не
содержащих готового токсина, были обнаружены жизнеспособные споры
бактерий C. botuli num [74]. Sugiyama и Yang [1975] исследовали способность
гриба (Agaricus bisporus) поддерживать рост инокулированных спор бактерий
C. botulinum. После инокуляции разных частей грибов, они герметично
запаивались пластиковой пленкой и инкубировались. Токсины выявляли
через 3–4 дня инкубации продуктов при 20
0
С. Несмотря на то что
пластиковая пленка, используемая для заворачивания продуктов, позволяла
осуществлять газообмен, дыхание свежих грибов, потребляющих кислород с
65
гораздо большей скоростью, было существенно затруднено. При этом в
условиях хранения этих продуктов при температурах холодильника токсинов
не было обнаружено.
Довольно необычная вспышка массовых отравлений, включающая 36
случаев, произошла в 1985 г. Заболевшие были выявлены в 3 странах:
Канаде, Нидерландах и США. Пищевым продуктом, явившемся причиной
отравлений, был измельченный чеснок в соевом масле, упакованный в
стеклянные бутылки. Несмотря на то что на этикетках было указание хранить
продукт в холодильнике, неоткрытые бутылки хранились не на холоде в
течение 8 месяцев. Этот продукт использовали для нанесения и
пропитывания хлеба чесночным маслом, из которого, в свою очередь,
готовили сэндвичи с говядиной. В бутылках с чесночным маслом были
обнаружены ботулинические споры типа B. Образование токсина
происходило в течение 2 недель с момента инокуляции протеолитических и
не протеолитических B-штаммов в бутылки с измельченным чесноком в
масле при 25 °С хранения. Токсины типа A и B продуцировались в бутылках
с измельченным чесноком за 20 дней при 35 °С после инокуляции
соответствующих спор в количестве 1спора/грамм. В последнем
исследовании высокотоксичное содержимое стеклянных бутылок на вид и
запах выглядело вполне приемлемыми съедобным. В 1991 г., в Египте
произошла вспышка массовых отравлений ботулизмом (токсин типа E),
которая включала 91 случай заболеваний, 20 из которых закончились
смертельным исходом. Зараженной пищей в этом случае была непотрошеная
сырая соленая рыба под названием «фасейх».
В 1994 г. зарегистрировано 30 случаев отравления в Эль-Пасо, штат
Техас, после употребления картофельного соуса и баклажанного соуса,
каждый из которых содержал печеный картофель. При этом запеченный
картофель был завернут в алюминиевую фольгу и хранился при комнатной
температуре в течение нескольких дней, став, таким образом, токсигенным.
66
Хотя это и не правило, но не единственный случай, когда ботулинический
токсин обнаруживали в запеченном картофеле.
Одна из зарегистрированных вспышек отравления ботулизмом, где
причиной был токсин типа F (пять случаев заболеваний и один смертельный
исход), была вызвана употреблением печеночного паштета домашнего
изготовления. В 1996г. произошла также вспышка отравления ботулизмом в
США после употребления вяленой оленины, где было зарегистрировано три
клинических случая.
Самая большая опасность заражения ботулизмом исходит от продуктов
домашнего приготовления, особенно от продуктов домашнего
консервирования в банках в результате неправильно применяемой
технологии или недостаточной температурной обработки для разрушения
ботулинических спор. Такая пища часто употребляется без предварительного
нагревания. Наилучшей превентивной мерой является температурная
обработка подозрительной пищи при температуре кипения в течение
нескольких минут, что является достаточным для разрушения
нейротоксинов.
Детский ботулизм
Признанный впервые как таковой в Калифорнии в 1976 г., детский
ботулизм был с тех пор подтвержден во многих штатах США и многих
других странах.
У взрослых заражение ботулизмом происходит, как правило, при
заглатывании уже готовых токсинов, в то время как в случае детского
ботулизма происходит заглатывание ботулинических спор, которые при
созревании и прорастании в желудочно-кишечном тракте синтезируют и
выделяют токсины. Несмотря на то что у некоторых взрослых, при
определенных условиях, возможно прорастание ботулинических эндоспор и
продукция небольшого количества токсинов, кишечный тракт,
колонизованный огромным количеством другой микрофлоры, не
способствует созреванию и прорастанию спор ботулинической палочки.
67
Дети старше одного года не столь подвержены возникновению этого
синдрома, поскольку в их кишечнике уже успевает установиться нормальный
микробиотический баланс. У некоторых детей последствия заболевания
бывают достаточно мягкими, у других же оно протекает в тяжелой форме. В
острой стадии заболевания в экскрементах детей обнаруживают большое
количество спор, а в ходе выздоровления число спор уменьшается.
Диагностика заболевания осуществляется при выявлении
ботулинических токсинов в фекалиях детей, а также используют тест на
летальность мышей. Поскольку бактерия Clostridium difficile выделяет в
кишечный тракт детей летальные для мышей токсины, при диагностике
необходимо бывает всегда различать токсины, а также виды и штаммы
ботулинических бактерий.
Дети заражаются жизнеспособными спорами, употребляя детское
питание и, возможно, от окружающей среды. Пища, которая становится
источником заражения, как правило, не проходит температурной обработки
для разрушения эндоспор.
Чаще всего такими продуктами становятся сироп и мед. Из 90
исследованных образцов меда 9 содержали жизнеспособные споры. Шестью
из них были накормлены дети, заболевшие детским ботулизмом. Из 9 этих
образцов, 7 содержали эндоспоры типа B, а два остальных — типа A. Из 910
исследованных образцов детского питания, приготовленного из 10
различного класса продуктов, только 2 класса были позитивны в отношении
спор: мед и кукурузный сироп. Два образца меда из 100 исследованных
содержали споры типа A, а 8 из 40 образцов кукурузного сиропа были
заражены спорами типа B. Только один из 150 обследованных образцов меда
в Канаде содержал жизнеспособные ботулинические споры (типа A), один из
40 обследованных образцов сухой овсяной каши содержал споры типа
B то время, как 43 образца сиропа совсем не содержали спор. Из
зарегистрированных в США заболеваний в период с 1997 по 1982 г. было
отмечено 62 случая отравления детей ботулизмом в возрасте от 8 до 48
68
недель. Токсины типа A и B в равной степени были причиной этих
отравлений. Первые два случая отравлений, зарегистрированных в Риме,
Италия, были вызваны токсином типа E, который выделяется бактериями
Clostridium butiricum. Первым из зарегистрированных случаев детского
ботулизма в Японии было отравление токсином типа B в 1995 г.
Биологические свойства возбудителя ботулизма - Cl. botulinum
Cl. botulinum относится к семейству Bacillaceae, роду Clostridium.
Микроорганизмы этого рода широко распространены в природе. Он часто
содержится в почве, навозе, грунте водоемов и др. Микроорганизм способен
образовывать споры и в этом состоянии очень устойчив к различным
воздействиям. Если вегетативная форма палочки ботулинум гибнет при 80 °С
через 15—30 мин, то споры термостабильны и выдерживают кипячение до 6
ч. В процессе автокпавирования при 120°С споры CI. botulinum типа F —
гибнут только через 60 мин и более. Споры могут продолжительное время
сохраняться в пищевых продуктах и во внешней среде. В высушенном
состоянии сохраняются десятилетиями. Устойчивы к низким температурам
(до -190°С), химическим веществам (20% раствор формалина уничтожает
споры через 24 ч, 5%-й раствор фенола — через сутки и более, в этиловом
спирте и 15%-м растворе хлорида натрия споры сохраняют
жизнеспособность до 2 мес.)
В настоящее время известно 7 типов возбудителей ботулизма — F, В,
С, D, Е, F, G, сходных по морфологическим, культуральным свойствам и
действию токсинов на организм. Токсины разных типов возбудителя
отличаются антигенными свойствами.
Морфология. CI. botulinum — подвижная, крупная (4—9 мкм) палочка,
образующая споры овальной формы, расположенные чаще всего
субтерминально, то есть ближе к одному из полюсов клетки. Диаметр спор,
как и у других клостридий, больше диаметра вегетативной клетки. Наличие
такой споры придает CI. botulinum
вид «теннисной ракетки» или «пламени
свечи». Капсул эти микроорганизмы не образует, по Граму красятся
69
положительно (в старых культурах — отрицательно), в мазках из чистых
культур расположены чаще всего одиночно, беспорядочно, иногда парами
или короткими цепочками.
Культуральные свойства. CI. botulinum — строгий анаэроб.
Оптимальная температура роста и токсинообразования — 28—35 °С. При
росте CI. botulinum на среде Китта-Тароцци наблюдается ее помутнение с
последующим просветлением и выпадением осадка; появляется характерный
запах прогорклого масла, сырный, гнилостный. На сахарно-кровяном агаре
Цейслера образуются прозрачные колонии величиной в несколько
миллиметров, блестящие, неправильной формы с тонкими нитевидными
отростками, окруженные зоной гемолиза. Середина колоний может быть
слегка вогнутой или выпуклой, иногда они окрашены в коричневатый или
сероватый цвет. В столбике сахарного агара (в трубках Вейона) колонии
имеют форму чечевицы или комочков ваты с уплотненным центром.
Ферментативные свойства. CI. botulinum типов А, В, F обладают
протеолитической активностью, например, они полностью переваривают
кусочки печени на среде Китта-Тароцци, разжижают желатин.
Сахаролитические свойства у этих микроорганизмов непостоянны и не могут
служить критерием идентификации микроба и дифференциации его
сероваров. CI. botulinum не ферментирует лактозу, сахарозу, маннит,
способность сбраживать глюкозу, мальтозу и салицин варьирует. Нитраты
они не восстанавливают, индол не образуют, выделяют сероводород.
Свойства токсина CI. botulinum и условия его накопления в
пищевых продуктах. CI. botulinum продуцирует наиболее сильный из всех
бактериальных ядов экзотоксин. Смертельная доза этого токсина для
человека и морской свинки составляет 0,0000001 г. Человек наиболее
чувствителен к токсинам типов А, В, Е и F, а животные — к типам С и D.
Токсинообразование зависит от рН продукта. Оптимальна для этого
процесса нейтральная или слегка щелочная реакция среды. В кислой среде
токсинообразование тормозится и прекращается. Оптимальная
70
температура для токсинообразования — 35—37 °С, но он может
образовываться и при 15°С. При 25°С в мясе токсин образуется за 24—40 ч.
При холодильном хранении продуктов токсин не образуется, но и не
разрушается, если он накопился в продукте ранее. Ботулинистический токсин
перестает накапливаться только при концентрации соли в среде 8—10%.
Накопление токсина происходит только в анаэробных условиях.
Хорошие условия для токсинообразования создаются в различных
консервах, при солении и копчении мясных и рыбных продуктов большими
кусками, а также при помещении пищевых продуктов в вакуумную упаковку.
Консервы, содержащие ботулинистический токсин, в большинстве случаев
имеют явные признаки порчи: бомбаж, прогорклый запах, изменение цвета и
консистенции. Однако бывают случаи, когда CI. botulinum не вызывает
заметной порчи и изменений органолептических показателей продукта. В
пищевых продуктах плотной консистенции CI. botulinum может
размножаться и накапливать токсин «гнездно». При этом пищевой продукт,
например батон колбасы, может быть совершенно безвредным в одном
участке и смертельно ядовитым — в другом участке.
Токсины палочки ботулинум устойчивы ко многим физическим и
химическим факторам. Они не разрушаются полностью под действием
солнечного света, воздуха. В кислой среде устойчивость накопившегося
токсина выше, чем в щелочной. Токсин не разрушается в желудочнокишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов. Копчение,
вяление, соление, замораживание продуктов, содержащих уже накопившийся
токсин, не ослабляет его действие.
Токсин, выделяемый палочкой ботулинум, имеет белковую
природу и разрушается при кипячении в течение 10—20 мин.
Выявление ботулинистических токсинов
Ботулинистические токсины в пищевых продуктах выявляют,
руководствуясь ГОСТ 10444.7—86. Продукты пищевые. Методы
выявления ботулинистических токсинов и CI. botulinum.