Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Патогенные анаэробы рода Clostridium в ветеринарной медицине. Учебное пособие для студентов ветеринарного факультета.pdf
51
др.), содержащих ботулинистический токсин. Иногда попавшие с пищей
споры палочки CI. botulinum способны в кишечном тракте прорастать в
вегетативные формы, то есть заболевание может протекать по типу
токсикоинфекции, чем и объясняются случаи ботулизма с затяжным
инкубационным периодом (от 2 до 10 дней и более).
При ботулизме у людей редко наблюдаются диспепсические явления,
такие как рвота и понос. Все основные симптомы вызваны действием
токсина CI. botulinum, который быстро всасывается в кровь и поражает
центральную нервную систему. Температура тела при этом часто
понижается. Затем наступает расстройство глотания, сиплость голоса,
ослабление слуха и нарушение двигательных функций. Больные жалуются на
невнятную речь, двоение в глазах и неясность зрения, ощущение инородного
тела в глотке, сильную слабость. На последней стадии течения болезни
наступает паралич дыхания и сердечной деятельности, являющийся
причиной смерти. Смерть наступает при ясном сознании. Летальность у
людей достигает 40—60%, иногда даже до 85%.
Ботулизм вызывается некоторыми штаммами бактерий Cl. botulinum.
На основании серологической спецификации их токсинов определены семь
типов: A, B, C, D, E, F и G. Токсины A, B, E, F и G вызывают заболевания у
человека; тип С вызывает ботулизм у домашней птицы и дичи, рогатого
скота, норки и других животных; тип D связан с отравлением скота фуражом.
Дифференциация типов штаммов осуществляется также на основании
их протеолитической активности. Типы A и G являются протеолитическими,
также как и некоторые из штаммов, принадлежащих к типам B и F. Тип E не
протеолитический, так же как и некоторые из штаммов, принадлежащих к
типам B и F. Протеолитическая активность штаммов типа G слабее, чем у
штаммов типа A, и для действия их токсина необходимо участие трипсина.
Все штаммы, продуцирующие токсин типа G, объединены внутри вида Cl.
argentinense. Штаммы этого вида были выделены из почв Аргентины,
Швейцарии и США.
52
Все токсин - продуцирующие штаммы были помещены в одну их
четырех групп — I, II, III или IV. Штаммы группы I содержат
протеолитические ферменты, штаммы группы II не являются
протеолитическими, а штаммы группы IV по серологическим показателям
относятся к типу G. Группа III состоит из штаммов, относящихся к типам C и
D. Интересно отметить, что два ботулинических токсина были определены у
видов, не относящихся к Cl. botulinum. Токсин типа F продуцируется
бактериями Clostridium baratii, а нейротоксин, который по антигенным
свойствам похож, но не идентичен типу E, вырабатывается бактериями
Clostridium buti ricum. В последнем случае ген токсина был транспортирован
от токсигенного штамма Cl. butiricum к не токсигенному реципиенту Cl.
botulinum, относящегося к типу E, с помощью трансдукции дефектным
бактериофагом, который, таким образом, превратился в инфекционный с
помощью хэлперного штамма
. Ген токсина типа E является хромосомным в
обоих случаях. Можно только предполагать, что соответствующие штаммы
Clostridium baratii приобрели способность вырабатывать токсин с помощью
подобного же механизма. Токсин Cl. baratii обладает молекулярным весом
около 140 кДа. Было показано, что штаммы Cl. butiricum, которые
вырабатывают токсин типа E, проявляют эту активность при рН в области 4,8
в течение периода, равного 43–44 дням. Установлено также, что наиболее
о
низкой температурой роста является 12
типа E определяли через 15 дней, в то время как при температуре роста 25
C, и при такой температуре токсин
о
C
токсин обнаруживали через пять дней в сыре и в соусе.
Распространение бактерии C lostridium botulinum
Этот организм населяет почву и воду. В США штаммы типа A чаще
выявляются в почвах западных штатов, а штаммы типа B обнаруживаются
чаще в восточных штатах и в Европе. Были сообщения, что в почвах и навозе
разных стран содер
жится 18% спор штаммов типа A и 7% спор штаммов
типа B. При исследовании искусственно культивируемых образцов почв
показано, что 7% содержат эндоспоры штаммов типа A и 6% — типа B.
53
Споры штаммов типа E имеют тенденцию локализоваться в воде, особенно в
морской. При исследовании образцов ила из гавани Копенгагена Pederson
[1955] обнаружил, что 84% содержат споры типа E, в то время как в образцах
почвы, взятых из городского парка, содержалось только 26 % спор этого
типа. При исследовании 684 природных образцов из Дании, Исландии,
Гренландии, Фаросских островов и Бангладеш установлено, что 90%
образцов из водных источников Дании и 86% образцов морской воды
Гренландии содержали споры типа E. Э
тот штамм не был обнаружен в
почвах Дании, но там выявили штамм B. Основываясь на этих данных, Huss
[1965] предположил, что бактерии штамма E являются истинно водными
организмами, которые размножаются в мертвых животных, находящихся в
воде и в осадках и распространяются течениями и мигрирующими рыбами.
Известно, что какое-то время споры бактерий штамма E обнаруживали в
морской воде у берегов северной Японии. Присутствие этого организма в
воде Мексиканского залива у побережья штата Мэн и в заливах Венесуэлы,
твердо установлено. Исследование образцов почв в России показало наличие
бактерий Cl. botulinum при доминировании штаммов типа E. При изучении
333 образцов, взятых с финских ферм по разведению форели, штаммы типа E
были обнаружены в 95% на 21 ферме. Бактерии этого типа выявлены также в
68% проб, взятых из осадков, а также в 15% образцов кишечника рыб и 5%
кожи рыб. В то же время во всех этих пробах не было выявлено бактерий
типов A, B и F. Согласно данным этих исследователей, Балтийское море
имеет наивысший в мире уровень зараженности бактериями штамма E.
Что касается численности бактерий Cl. botulinum в почвах, сделано
предположение, что она не превышает или меньше одной на грамм. При этом
не протеолитические типы заселяют преимущественно воду, нежели почвы и,
открытие этих типов бактерий произошло в период между 1960 и 1969 гг.
Более позднее распознавание бактерий некоторых штаммов, возможно,
является следствием низкой устойчивости к температуре не
54
протеолитических типов, которые могли разрушаться в образцах при
обычной температурной обработке для проращивания спор.
Первый тип F штаммов был выделен Moller и Scheibel [1960] при
вспышке ботулизма, вызванной употреблением печеночного паштета
домашнего приготовления, которая была зарегистрированы на датском
острове Лангелэнд. Позднее Craig и Pilcher [1966] выделили споры типа F из
лосося, выловленного в реке Колумбия; Eklund и Poysky [1965] обнаружили
споры типа F в морских отложениях, взятых у берегов Орегона и
Калифорнии; Williams-Walls [168] выделил два протеолитических штамма из
крабов, собранных в реке Йорк в Вирджинии, и Midura с коллегами [1970]
выделили споры этого типа из оленя в Калифорнии.
Впервые штамм типа G был выделен в 1969 г. из почвы в Аргентине,
позднее эти бактерии были выделены из человеческих трупов в Швейцарии.
До сих пор бактерии этого штамма не были обнаружены в очагах пищевых
отравлений, и объяснение этому факту может быть в том, что этот штамм
продуцирует значительно меньше нейротоксина, чем бактерии типа A. Было
показано, что бактерии типа G продуцируют 40 LD 50 /мл токсина в среду,
тогда как тип A обычно выделяет от 10 000 до 1 000 000 LD 50 /мл токсина,
однако при определенных условиях бактерии типа G могут быть
индуцированы и продуцировать до 90000 LD 50 /мл токсина в среду.
Рост бактерий Cl. botulinum
Пищевые потребности этих микроорганизмов очень сложны и
включают аминокислоты, витамины группы B и минеральные вещества.
Разработаны синтетические среды, которые поддерживают рост и продукцию
токсинов большинства типов. Протеолитические штаммы не имеют
тенденции преимущественного роста на углеводах, в то время как не
протеолитические штаммы, напротив, хорошо растут на углеводах. В то же
время не протеолитические штаммы имеют гораздо большую тенденцию к
сбраживанию, чем протеолитические.
55
Протеолитические штаммы, как правило, не растут при температурах
ниже 12,5
минимум, равный 10
0
C, однако есть несколько отдельных сообщений, постулирующих
0
C. Верхним пределом температуры роста для штаммов
типа A и протеолитических штаммов типа B, а также предположительно и
о
для других протеолитических типов является 50
C. С другой стороны, не
протеолитические штаммы могут расти даже при минимальной температуре,
равной 3,3
0
C, при максимуме на пять градусов ниже, чем протеолитические.
Минимумы и максимумы температур роста этих организмов зависят от
других параметров роста, и можно предполагать, что указанные минимумы и
максимумы температур роста справедливы только при полностью
оптимальных других условиях, таких как рН и остальных. При исследовании
минимальных допустимых температур для роста и продукции токсинов не
протеолитическими штаммами, относящимися к
типам B и F в мясном
бульоне и мясе крабов, оба росли и выделяли токсин при 4 0C в мясном
бульоне, однако в мясе крабов рост и выделение токсина осуществлялось
0
только при 26
C, а при 12 0C и ниже рост и продукция токсина были
полностью блокированы. Штамм типа G мог расти и продуцировать токсин
0
при 12
C, но не при 8оC.
Минимальное значение рН, которое позволяло расти и производить
токсины различным штаммам Cl. botulinum, было предметом многих
исследований. Как правило, рост не выявляется при значениях рН ниже 4,5, и
именно этот факт определяет режим тепловой обработки пищевых продуктов
при значениях рН ниже этого уровня. Поскольку ботулинические токсины
обнаруживают в некоторых пищевых продуктах домашнего консервирования
с высоко кислотной средой, эта область так же была предметом
исследований. В одной из работ не было выявлено роста бактерий типов A и
B в томатном соке, имевшем рН около 4,8, однако после инокуляции клеток
мицелиального гриба Aspergillus gracilis и образовании мицелиальной
пленки, продукцию токсина регистрировали при рН, равном 4,2. В другом
исследовании при начальном рН томатного сока, равном 5,8, по мере роста
56
грибного мицелия и образования пленки, значение рН в области
непосредственно под пленкой повышалось до 7,0 через 9 дней роста и до 7,9
через 19 дней. При инокуляции томатного сока ботулиническими спорами
типа A одновременно со спорангио спорами мицелиальных грибов
Cladosporium sp. и Penicillium sp. в верхней части (0,5мл) этого продукта рН
повышалось от значения 5,3 до 6,4 или 7,5 соответственно через девять и 19
дней роста. Показано, что один из штаммов типа B выделял газ в томатном
соке при значении рН 5,24 после 30 дней роста и при рН, равном 5,37 через 6
дней роста. В пищевых смесях, состоящих из целых креветок, креветочной
пасты, томатной пасты и креветочно-томатной пасты, подкисленной до рН
4,2 с помощью уксусной кислоты или до рН 4,6 с помощью лимонной
кислоты, не было выявлено ни роста, ни продукции токсина ни для одного из
о
штаммов ботулинических бактерий, относящихся к типу E при 26
C в
течение 8 недель. В другой работе показано, что рост бактерий типа E и
продукция токсина были зарегистрированы при рН 4,2 и температуре 26
о
C
через 8 недель при условии, что для регулирования рН в культуральной среде
использовали лимонную, но не уксусную кислоту. Как правило, минимум рН
практически одинаков как для протеолитических, так и для не
протеолитических штаммов.
При внесении инокулятов бактерий из четырех штаммов типа A и двух
штаммов типа B в водные суспензии соевых белков и их инкубации при 30
0
C рост наблюдали в условиях рН 4,2; 4,3 и 4,4. Инокулюм содержал 5 х 106
спор/мл. Токсин обнаруживали в среде через четыре недели роста при
значении рН 4,4; регулирование рН с помощью соляной или лимонной
кислоты. При использовании для регулирования рН молочной или уксусной
кислот для появления токсина в среде требовалось соответственно 12 и 14
недель роста при значении рН 4,4.
Вносимый в экспериментах инокулюм, содержавший 103 –10
ботулинических спор/г, представлял значительно большее количество этих
микроорганизмов, чем мо
жет быть выявлено в продуктах питания в
4
57
естественных условиях. Тот факт, что рост ботулинических бактерий в
условиях эксперимента мог происходить при значении рН ниже 4,5, еще не
опровергает широко распространенного мнения, что при содержании в
значительно меньшем количестве в естественных условиях в пище эти
организмы не могут расти при значениях рН ниже 4,5.
При изучении соотношения различных факторов роста, таких как
значение рН, концентрация NaCl и температура в японском супе с лапшой
было выявлено, что при выращивании спор ботулинических бактерий типов
A и B не обнаруживали токсинов в среде в следующих условиях: (1) при рН
6,5; 4% NaCl и 20
0
и 30
C; и (4) при рН 6,0; 4% NaCl и 30 0C.
0
C;(2) при рН 5,0; 1% NaCl и 30 0C;(3) при рН 5,5; 3% NaCl
Определенно установлено, что минимальным значением "a", "w" ,
которое позволяет расти и выделять токсины штаммам ботулинических
бактерий типа A и протеолитическим штаммам типа B является 0,94. Для
штаммов ботулинических бактерий типа E это значение составляет около
0,97. Хотя и не все штаммы изучены достаточно хорошо в равной степени.
Предполагается, что другие, не протеолитические штаммы, могут расти при
примерно таком же минимальном значении "a", "w", к "у" штаммов типа E.
Минимальное значение "a", "w "в культуральной среде определяется также
тем, каким способом оно достигается. При использовании глицерина в
качестве влагоудерживающего вещества значение "a", "w" , устанавливается,
как правило, немного ниже, чем в случае, когда используют NaCl или
глюкозу. При содержании солей на уровне около 10% или 50% сахарозы
ингибируется рост штаммов типов A и B. Кроме того, установлено, что 3–
5%-е содержание солей ингибирует выделение токсинов в копченой рыбе
семейства карповых. В присутствии нитритов для роста этих организмов
необходимо снижение уровня концентрации солей.
Что касается устойчивости к температуре, протеолитические штаммы
являются гораздо более устойчивыми, чем не протеолитические. Несмотря на
то что значения, представленные в таблице, предполагают, что бактерии
58
штаммов типа A являются наиболее устойчивыми к температуре, а вслед за
ними можно поставить протеолитические штаммы типа F и затем
протеолитические штаммы типа B, эти данные можно рассматривать только
как репрезентативные. Дело в том, что на эти свойства значительно влияют
такие факторы, как тип нагреваемого раствора, предыдущая история
штаммов и многие другие. Все рассматриваемые данные были установлены
при использовании в качестве раствора фосфатного буфера. Среди штаммов
типа E, два штамма, имеющие названия Alaska и Beluga, по всей видимости,
более устойчивы к температуре, чем другие, и при анализе рыбного фарша из
0
белого мяса карповых были определены значения D 80
соответственно 2,1 и 4,3, а при анализе мяса крабов значения D 82 2,
C, которые равнялись
0
C для
штаммов Alaska и Beluga равнялись соответственно 0,51 и 0,74. Что касается
копченой рыбы пород карповых, то в одном из исследований было показано,
что при нагревании до 180
0
С в течение 30 мин получали не токсигенный
продукт, тогда как в другой работе было показано, что 10–12% из 858
свежезакопченных карповых рыб, при такой же температурной обработке,
были заражены. Возбудителями были преимущественно штаммы E бактерий
Cl. botulinum.
В отношении клостридий, относящихся к типу G, аргентинский и
швейцарский штаммы оба образовывали два типа эндоспор: термолабильные
и термоустойчивые. Среди последних из этих штаммов бактерии,
0
разрушаемые при 80
С в течение 10 мин, составляют 99% спор в культуре
швейцарских штаммов. Среди бактерий аргентинского штамма только одна
эндоспора из 10 000 является термоустойчивой. Значения D 82 2,
0
C для двух
термоустойчивых штаммов в фосфатном буфере были равны соответственно
0,45–0,54 мин, в то время как для двух термолабильных штаммов — D 82 2 ,
0
C составляло 1,8–5,9 мин. Более термоустойчивые споры штаммов типа G не
распространены. Токсигенные штаммы C. butiricum росли и продуцировали
токсин при рН 5,2, но не росли при рН 5,0. Термоустойчивые штаммы (не
59
токсигенные) росли при рН 4,2 и были значительно более устойчивы к
температуре, чем нетоксичные.
Были сообщения, что в отличие от температуры радиационное
излучение, по всей видимости, воздействует на эндоспоры как
протеолитических, так и непротеолитических штаммов в одинаковой степени
со значением D от 1,1 до 2,5 кГр. Однако в одном из исследованных случаев
значение D для не протеолитического штамма типа F, равное 1,5 кГр, было
таким же, как и значение D для штамма типа A, в то время как у
протеолитического штамма типа F значение D было равно 1,16 кГр.
Отдельной темой исследований процессов роста и продукции токсинов
бактериями штаммов Cl. botul inum является способ Sous Vide приготовления
пищи при относительно низкой температуре (около 60 0С). В соответствии с
этим методом, разработанным во Франции в 1980 г., сырая пища помещается
в герметически закрытые мешки и готовится под вакуумом. Если не все, то
большинство вегетативных клеток при этом разрушается, но бактериальные
споры выживают. Таким образом, продукт, приготовленный этим способом,
содержит бактериальные споры в условиях сильно пониженного содержания
кислорода и полного отсутствия других бактерий-конкурентов. В
содержащей мало кислот пище, такой как мясо, птица и морепродукты,
споры Cl. botulinum могут прорастать, расти и производить токсин.
Температура выдерживания и время являются двумя особо важными
параметрами, которые должны тщательно контролироваться, чтобы избегать
получения токсических продуктов.
В то время как протеолитические штаммы не растут при температурах,
поддерживаемых в холодильниках, не протеолитические штаммы могут
расти при этих температурах. Все опубликованные данные о
распространенности ботулинических спор в мясе и птице свидетельствует о
чрезвычайно низком их содержании — менее одной споры на грамм. Если в
среднем содержание ботулинических спор определяется как 1 спора/г, то
можно предположить, что при постоянном хранении в условиях 3–5
о
С и
60
низком содержании кислот приготовленные по способу sous vide мясные
продукты должны быть безопасны по крайней мере в течение 21 дня. При
инокулировании филе морского окуня смесью разных ботулинических
бактерий из 13 штаммов, относящихся к типам
B, E и F в количестве,
примерно соответствующем 1 споре на образец, не могли детектировать
токсин в течение 21 дня при температуре хранения 4
0
С. Тот же результат
был получен при инкубации гомогената красного луциана в тех же условиях
обработки. При инокуляции в тех же условиях упакованной методом
о
модифицированной атмосферы (MAP) свинины и хранении при 5
С
ботулинический токсин не выявляли в течение 44 дней. Достаточно
длительные сроки хранения продуктов при постоянной низкой температуре
сокращаются при нарушениях температурного режима. Однако в случаях,
когда у продуктов имеются вторичные барьеры, такие как, например,
активность воды "a", "w" - 0,93 или рН - 4,6, они остаются безопасными в
течение более длительного времени даже в этих случаях. В некоторых
случаях споры Bacillus spp. могут быть более многочисленными, чем
ботулинические и, поскольку некоторые из них могут прорастать и расти при
рН 4,6, то не кажется столь невероятным, что бациллы колонизируют
продукт, растут и в результате повышают рН при нарушениях
температурного режима. Ботулинический токсин выявляли в лапше,
хранящейся в анаэробных условиях с исходным рН 4,5, когда значение рН
повышалось в результате роста микроорганизмов. Существует общепринятое
мнение, что в рыбе содержится больше ботулинических спор, чем в
продуктах из наземных животных, и следовательно, рыбные продукты более
опасны при хранении.
В серии исследований объектом была хранящаяся по технологии MAP
сырая рыба, инокулированная не протеолитическими штаммами
ботулинических клостридий. 74,6% экспериментальных вариаций в
финальной множественной линейно-регрессионной модели происходило в
результате изменения температуры хранения, а такой параметр, как