Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Патогенные анаэробы рода Clostridium в ветеринарной медицине. Учебное пособие для студентов ветеринарного факультета.pdf
21
В природе встречаются как полезные, так и вредные анаэробы.
Например, в кишечнике животных и человека имеются анаэробы,
приносящие пользу хозяину (B. bifidus), играющие роль антагонистов к
вредной для человека микрофлоре. Этот микроб сбраживает глюкозу и
лактозу и образует молочную кислоту. Расщепление клетчатки в животном
организме осуществляется анаэробами и актиномицетами. В основном этот
процесс протегает в пищеварительном тракте. В основном анаэробы
встречаются в преджелудках и толстом отделе кишечника.
Но в кишечнике есть гнилостные и патогенные анаэробы. Они
расщепляют белки, вызывают гниение и различные виды брожения,
выделяют токсины (С L. putrificus, С L perfringens, С L. tetani).
Факультативные анаэробы (стафилококки, сальмонели, и другие) –
приспособились, в зависимости от условий среды (наличию или отсутствию
кислорода), переключать свои метаболические процессы с использованием
молекулярного кислорода на брожение и наоборот. Типичным
представителем факультативных анаэробов является Е. coli, которая в
углеводной среде сначала развивается как анаэроб, расщепляя углеводы
брожениям, потом начинает потреблять кислород и растет как аэроб, окисляя
продукты брожения (молочная кислота) к углекислому газу и воде.
Факультативные анаэробы имеют значительные преимущества, так как они
могут жить как в кислородных, так и в бескислородных условиях.
Микроаэрофилы (молочнокислые бактерии) – особенная группа
микробов, для которых концентрация кислорода при культивировании может
быть уменьшена до 2 %. Высшие его концентрации способны задерживать
рост.
Выращивание анаэробов более сложно, чем культивирование
аэробных микроорганизмов.
Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные
условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного
кислорода из питательной среды и внешнего пространства.
22
Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение
анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого
количества посевного материала в питательную среду.
Для культивирования анаэробов применяют физические, химические и
биологические методы.
Особенности выделения и культивирования анаэробов клостридий
Методы создания бескислородных условий
Для культивирования анаэробных микроорганизмов необходимо
создание бескислородных условий, достигаемое различными методами.
Выведение облигатно анаэробных микроорганизмов существенно
отличается от изучения других типов бактерий, так как если в атмосфере
содержание О
будет превышать 0,1%, то они погибнут. Поэтому при
2
изучении этих микроорганизмов необходимо соблюдать определённые
правила, иначе их нарушение может привезти к искажению результата или
вовсе гибели анаэробов. Первым, кто смог удачно произвести выделение
анаэробов, стал Л.Пастер на исходе XIX века. С того времени учёные
применяли огромное количество способов и методов для выведения данных
микроорганизмов, от многих пришлось отказаться в виду их сложности или
не практичности, но на замену им пришли более совершенные современные
методы.
Большинство бактерий — облигатных анаэробов — способны
развиваться при окислительно-восстановительном потенциале субстрата не
выше минус 0,33 в. Для сравнения можно отметить, что рН воды при
нормальном атмосферном давлении составляет +0,80 в. Результативность
культивирования в анаэробных условиях зависит прежде всего от того,
насколько удается снизить окислительно-восстановительный потенциал
субстрата до указанного уровня. Осуществить это можно путем, удаления
молекулярного кислорода. При анаэробном культивировании для удаления
кислорода используют как механические, так и химические средства.
Культивированию в анаэробных условиях способствует и добавление в
23
питательную среду небольших доз восстановителей, нетоксичных для
данных микроорганизмов.
Физические методы основаны на создании вакуума в специальных
аппаратах — анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо
другим газом, например, СО
. Доступ кислорода в питательную среду можно
2
затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика сахарного
агара или среды Вильсона — Блера, налитых в пробирки в расплавленном
состоянии и остуженных до 43°С. По методу Вейона — Виньяля
расплавленный и остуженный агар с посевным материалом набирают в
стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.
Химические методы заключаются в том, что при культивировании
исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают
химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между
которыми идет с поглощением кислорода. В жидкие питательные среды
можно добавлять различные редуцирующие вещества: аскорбиновую или
тиогликолевую кислоту.
Биологический метод основан на одновременном культивировании
аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в чашках Петри,
герметически закупоренных. Вначале кислород поглощается растущими
аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост
анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Наиболее удобна для
культивирования анаэробов специальная среда Китта — Тароци. В нее
входят сахарный МПБ, который наливают в пробирки в количестве 10—12
мл, и кусочки вареных паренхиматозных органов. Перед употреблением
среду Китта—Тароцци кипятят на водяной бане для удаления растворенного
в ней кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом.
Заметный рост анаэробов (помутнение) может наблюдаться через 48 ч и
более в зависимости от количества посевного материала.
Рост изолированных колоний анаэробов можно получить при рассеве
исследуемого материала по поверхности кровяно-сахарного агара, разлитого
24
в чашки Петри. После посева чашки помещают в анаэростат. Исследуемый
материал в убывающей концентрации можно засевать в высокий столбик
агара. Образовавшиеся отдельные колонии анаэробов выделяют, распилив
пробирку в месте роста. Колонии анаэробов для получения значительного
количества биомассы отсевают затем на среду Китта — Тароцци. В качестве
источника энергии для анаэробов используют глюкозу, добавление которой в
питательную среду обязательно.
Культивирование в запаянных трубках. Данный метод, получивший
распространение при выращивании культур на жидких питательных средах, с
успехом может быть применен и для культивирования в анаэробных
условиях. Для этого используют специальные пробирки, суженные в верхней
трети. После внесения посевного материала в питательный бульон в
пробирку вводят ватную пробку, проталкивая ее до сужения. Затем из
пробирки откачивают воздух и с помощью специальной газовой горелки
оплавляют ее суживающуюся часть. Запаянные трубки инкубируют в
термостате. О размножении анаэробных микроорганизмов свидетельствует
помутнение питательной среды.
На сегодняшний день основными методами культивирования
анаэробов в микробиологических исследованиях являются:
• Метод Вейнберга. Изучаемый материал разводили в
специальном изотоническом растворе. Далее помещали посевы в пробирки с
охлаждённым до 45ºС сахарным агаром (или же использовалась среда
Вильсон –Блера).
• Метод Вильяля –Вейона. Материал разводили в расплавленной
среде Вильсона –Блера, заранее охлаждённую до 45ºС, заливали в капилляры
пастеровских пипеток и запаивали их концы. Далее в течение трёх суток
хранили в цилиндре из стекла с выложенной на дне ватой. После чего
колонии вырастали и изолировались путём надломления капилляра выше
нахождения колонии и извлекались с помощью петли.
25
• Метод Аристовского или химический метод. Исследуемые
микроорганизмы в чашках Петри помещали в специальные стеклянные
ёмкости, у которых были притёрты края крышки (эксикатор). На дно
ёмкостей помещали химический поглотитель кислорода (например,
пирогаллол).
• Метод Форнера или биологический метод. В чашке Петри
создаётся специальная среда, состоящая из 5% агара и 1-2% глюкозы и
разделяется желобом на две половинки, где с одной стороны исследуемый
материал, а с другой – культура, активно поглощающих кислород, аэробов и
проводили герметизацию. Аэробы активно поглощали кислород в
герметичной среде, что давало возможность роста для анаэробов.
• Метод Цейсслера применяется для выделения чистых культур
спорообразующих анаэробов. Для этого производят посев на среду КиттТароц
ци, прогревают 20 мин при 80 °C (для уничтожения вегетативной
формы), заливают среду вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч в
термостате. Затем производят посев на сахарно-кровяной агар для получения
чистых культур. После 24-часового культивирования интересующие колонии
изучаются — их пересеивают на среду Китт-Тароцци (с последующим
контролем чистоты выделенной
культуры).
Анаэробы культивируют на специальных питательных средах,
которые должны удовлетворять следующим требованиям:
а) соответствовать сложным пищевым потребностям анаэробов и
обеспечивать их быстрый рост, поэтому для культивирования анаэробов
используют высокопитательные среды, содержащие пептоны (1,5 – 2%),
дрожжевой экстракт (0,5%), витамин К, гемин;
б) содержать, при необходимости, стимулирующие добавки: бараньи
эритроциты (5%), лошадиную сыворотку (5-10%), твин-80 (0,02%); пируват
натрия (0,9%); глюкозу (0,5%); L – аргинин (0,1%);
в) иметь низкий окислительно-восстановительный потенциал, что
достигается путем добавления редуцирующих веществ. Редуцирующий
26
агент, связывая свободный кислород среды, снижает Рh среды. В качестве
нетоксичных редуцирующих агентов, обеспечивающих восстановительные
условия среды, используют цистеина гидрохлорид (0,025%), тиогликолят
натрия (0,05%), дитиотрейтол (0,05%). В некоторые среды (Китта-Тароцци)
добавляют кусочки тканей паренхиматозных органов (легкие, печень);
д) содержать селективные добавки, что обеспечивает избирательное
выделение облигатно анаэробных микроорганизмов. В качестве селективных
добавок используют антибиотики аминогликозидного ряда, к которым
анаэробы природно устойчивы.
Для выделения облигатно анаэробных микроорганизмов используют
следующие среды:
- анаэробный кровяной агар с гентамицином,
- анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой,
- анаэробный кровяной агар с канамицином и ванкомицином,
- фруктозо-циклосерин-цефокситиновую среду (для Clostridium
difficile),
- тиогликолевую полужидкую среду,
- среду Китта-Тароцци (жидкая среда с кусочками мяса и вазелиновым
маслом на поверхности),
- среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар). Clostridium spp.
растут в глубине столбика этой среды, давая колонии чёрного цвета за счёт
восстановления сернокислого натрия в сульфат натрия, который, соединяясь
с хлорным железом, образует чёрный осадок сернистого железа.
Посевы облигатно анаэробных микроорганизмов культивируют в
атмосфере с содержанием кислорода не более 0,1%. Бескислородные
условия для культивирования анаэробов создают с использованием
анаэробных камер, микроанаэростатов, либо анаэробных пакетов.
а) Анаэробная камера представляет собой герметичный прозрачный
бокс, перчаточный или бесперчаточный.
27
Анаэробные условия в нем достигаются созданием вакуума с
последующим заполнением пространства камеры анаэробным газом
трехкомпонентным (N
двухкомпонентным (N
(85%– 90%) + CO2 (5–10%) + Н2 (5%)) или
2
+ Н2). Устройство оснащено шлюзом для подачи из
2
агрессивной кислородсодержащей среды во внутреннее пространство камеры
образцов и расходных материалов. В камере также есть термостат,
устройство для поддержания и контроля влажности, палладиевый
катализатор для удаления остаточных количеств кислорода, прибор контроля
концентрации кислорода. Обеспечивает наивысшее качество анаэробного
культивирования. Отличается вместительностью (50–200 чашек Петри), все
диагностические исследования выполняются в бескислородной атмосфере.
б) Микроанаэростат (рис. 1) представляет собой цилиндрическую,
герметично закрываемую металлическую или пластмассовую емкость
объемом 2,5 (3–7) литров, используемую для инкубации посевов в
анаэробных условиях.
Рис. 1. Микроанаэростаты
Бескислородные условия в микроанаэростате создаются одним из двух
способов: создают вакуум и заполняют анаэробным газом;
1) вакуумзамещением.
28
2) химическим связыванием кислорода. Для химического связывания
кислорода используют газогенерирующие системы, которые после
добавления воды генерируют Н
и СО2. Н2 связывает в присутствии
2
палладиевого катализатора свободный кислород с образованием воды.
Генерируемый СО
необходим для стимуляции роста анаэробов, являющихся
2
капнофилами. В последнее время используют системы, связывающие
кислород за счет окисления соединений железа. Создание бескислородных
условий в микроанаэростатах контролируется индикаторной тест-полоской,
импрегнированной метиленовой синью, которая обесцвечивается в случае
образования бескислородной атмосферы.
Вместимость микроанаэростатов составляет 10–12 чашек Петри. Все
исследования проводят в кислородсодержащей атомосфере, а затем
загружают посевы в микроанаэростат, что снижает качество диагностических
процедур по сравнению с анаэробной камерой. Кроме того, отсутствует
возможность неограниченного наблюдения за посевами в процессе
инкубации. Микроанаэростаты используют в малых лабораториях, они
позволяют получить удовлетворительные результаты.
Основным недостатком данного агрегата является то, что исследования
проводятся в кислородосодержащей среде и только потом помещаются в
микроанаэростат, из-за чего качество результатов уступает анаэробной
камере.
в) Анаэробный пакет (Рис.2) представляет собой прозрачный,
герметично закрываемый пластиковый пакет, рассчитанный на 1–2 чашки
Петри. Анаэробные условия в нем создаются химическим связыванием
кислорода с безводной реакционной системой. Создание бескислородных
условий также контролируется индикаторной тест-полоской,
обесцвечивающейся в бескислородной атмосфере. Анаэробные пакеты
удобны для транспортировки материала, культур анаэробов, в экстренных
случаях, в полевых условиях, а также в лаборатории при малой
диагностической нагрузке. Прозрачность полиэтиленовых мешков позволяет
29
легко проводить периодический контроль роста микроорганизмов.
Анаэробные пакеты позволяют получить удовлетворительные результаты.
ис. 2. Газогенерирующие пакеты для анаэробов, микроаэрофилов
Р
Вм
естимость его до двенадцати чашек Петри и в основном
используется в небольших лабораториях.
Практический аспект знаний о клостридиях для
3.
микробиолога.
Блок 1. Сульфатредуцирующие клостридии как санитарно -
показательные микроорганизмы (СПМ).
Клостридии являются четвертым санитарно показательным
микроорганизмами (СПМ). Данный показатель предложен еще в 1895 году
одновременно с E. coli. Кляйн обнаружил Clostridium perfringens в сточных
водах и в кишечнике человека и предложил простой метод индикации - так
называемый энтеритный тест, название которого отражает источник
выделения и первое название микроорганизма (Bacterium enteritidis
sporogenes). Тест включает посев на молоко и обнаружение «штормовой»
реакции в нем (т.е. бурного сбраживания субстрата).
Клостридии, так же как энтерококки и БГКП, являются обитателями
30
кишечника человека и некоторых теплокровных животных и выделяются в
окружающую среду с фекалиями в количестве - 106 в 1 г. К имеющим
санитарно-показательное значение относятся главным образом С. perfringens
и С. sporogenes, способные редуцировать сульфит в сульфитных средах при
45° С в течение 12-24 ч. При определении санитарно-показательных
клостридий высчитывают количество их в 1 л воды или в 1 г почвы (индекс
клостридий). Как правило, в не загрязненных фекалиями образцах почвы
клостридий не обнаруживаются.
Clostridium perfringens — мезофильный, спорообразующий,
анаэробный микроорганизм семейства Clostridium, его относят к
сульфитредуцирующим клостридиям. Cl. perfringens является постоянным,
нормальным обитателем кишечного тракта человека и животных.
Существует шесть серовариантов Cl. perfringens, обозначаемых начальными
буквами латинского алфавита. Некоторые представители этих вариантов
могут быть патогенными. Например, типы В, С, D, Е — возбудители
энтеротоксемии различных животных, тип С — возбудитель некротического
энтерита людей.
Cl. perfringens представляет собой короткие, неподвижные,
грамположительные палочки размером 0,9—1,3—3,0—9,0 мкм, с
закругленными концами. В мазке они располагаются одиночно, попарно, в
виде цепочек или штакетообразных скоплений. Споры лучше образуются в
старых культурах, при доступе кислорода воздуха. В спороносных палочках
спора расположена субтерминально, ее диаметр больше диаметра
вегетативной клетки.
Cl. perfringens — анаэробные микроорганизмы. Их культивируют на
специальных средах для анаэробов. При культивировании создают
анаэробные условия физическим, химическим или биологическим
способами. В организме животных и человека они способны образовывать
капсулы. Споры Сl. perfringens термоустойчивы (особенно типов С и А,
которые выдерживают кипячение jn 2 до 6 ч). Сl. perfringens может вызывать