Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Патогенные анаэробы рода Clostridium в ветеринарной медицине. Учебное пособие для студентов ветеринарного факультета.pdf
91
Биохимические свойства. Сl. botulinum при посеве на среды с
сахарами ферментирует с образованием газа и кислоты: глюкозу, левулезу,
мальтозу, глицерин, декстрин, салицин, адонит, инозит и не разлагает
галактозу, сахарозу, дульцит, маннит, арабинозу и рамнозу. Однако эти
свойства непостоянны и не могут служить критерием идентификации
микроба и дифференциации его сероваров.
Бактерии сероваров А и В обладают высокой протеолитической
активностью: они полностью переваривают кусочки печени и мышц в
жидких средах; протеолитические свойства у серовара F выражены слабее и
минимальны у сероваров С, D и Е.
Токсинообразование. В анаэробных условиях в организме животных,
субстратах растительного и животного происхождения, а также на
специальных питательных средах С. botulinum синтезирует чрезвычайно
активный экзотоксин, относящийся к группе нейротоксинов. Самый сильный
токсин вырабатывает серовар А.
Каждый из семи сероваров возбудителя ботулизма обладает токсином,
имеющим только ему присущую антигенную структуру. В составе токсина
различают не менее пяти факторов: нейротоксин, гемолизин, гемолизингемагглютинин, липазу и протеазу. Токсическими факторами С. botulinum
также являются ферменты патогенности и среди них протеиназы, лецитиназы
и декарбоксилазы.
Антигенная структура. Все семь сероваров экзотоксина обладают
иммунологической специфичностью, выявляемой в реакции нейтрализации.
Специфичность токсинов сероваров А, В и Е очень высока, С и D - несколько
ниже. Токсины этих двух сероваров не нейтрализуются антитоксинами А, В
и Е, но небольшие дозы токсинов С и D перекрестно нейтрализуются
большими количествами антитоксинов D и С. Известен также факт
перекрестной нейтрализации специфическими антисыворотками
ботулинических токсинов сероваров Е и F.
92
Возбудители ботулизма имеют жгутиковый Н- и соматический Оантигены, четко развивающиеся в реакции агглютинации. О-антиген является
групповым, общим для протеолитических штаммов Сl. botulinum сероваров
А, В и С. sporogenes. Н-антиген типоспецифичен. Наблюдается совпадение
его (идентичность) у бактерий, различающихся по варианту экзотоксинов.
Устойчивость. Вегетативные клетки возбудителя малоустойчивы к
воздействию различных факторов внешней среды.
Температура 80 °С убивает их через 30 мин, кипячение - от 10 мин.
Резистентность спор высока. В высушенном состоянии они могут сохранять
жизнеспособность десятилетиями. К нагреванию споры более устойчивы в
среде, содержащей значительное количество жира. Наличие в среде ионов
железа, кальция, высокая концентрация сахарозы также повышают
устойчивость к нагреванию.
Споры- клостридий ботулизма сероваров А, В и F наиболее устойчивы
к кипячению; наименее резистентны споры серовара Е. Споры сероваров С и
D имеют промежуточную степень терморезистентности. Так, споры
сероваров А и В хорошо переносят кипячение при температуре 100 °С в
течение 5 ч и погибают только через 6 ч. При нагревании до 105
0
С споры
погибают не ранее чем через 2 ч, при 120 °С - через 20-30 мин. Поэтому
надежным способом обезвреживания спор возбудителя ботулизма является
автоклавирование не менее 30 мин при 120
0
С. Молодые споры из 6-10-
дневных культур сероваров А и В более устойчивы к температуре, чем споры
из старых культур.
Споры хорошо переносят низкие температуры и не погибают при
минус 190
0
С. При минус 16 °С сохраняются до года, но часть их при этом
разрушается. Споры сероваров А и В также обладают более высокой
радиорезистентностью. Они могут переносить облучение 2,5-3 Мрад, но эта
способность у различных штаммов неодинакова и зависит от состава среды,
ее рН и концентрации спор. Желудочный сок и пищеварительные ферменты
их не разрушают.
93
Устойчивы споры и к различным химическим бактерицидным
веществам.
В 5 %-ном феноле они сохраняются одни сутки, 10 %-ный раствор
соляной кислоты убивает их при комнатной температуре через 1 ч, 40 %-ный
формалин в двойном разведении - через 24 ч, в этиловом спирте они могут
сохранять жизнеспособность 2 мес. Такой же срок выдерживают они в среде,
содержащей 14 % поваренной соли.
Ботулинический токсин в жидких средах разрушается при кипячении
через 15-20 мин, в твердых субстратах - через 2 ч. Протеолитические
ферменты желудочно-кишечного тракта (пепсин, трипсин) не разрушают
токсины сероваров А, В, С, D, F, но усиливают активность токсина серовара
Е. В кислой среде при рН 3,5-6,8 устойчивость токсинов больше, чем в
щелочной, при рН 7,8 они значительно снижают свои токсические свойства,
рН выше 8,5 их инактивирует.
В зерне токсин может сохраняться месяцами; солнечный свет и
высушивание его ослабляют, но полностью не обезвреживают зерно в
течение 93 дней. Зерно, обработанное 1 %-ным раствором гидроокиси
натрия, теряет токсические свойства через 3-6 ч.
Патогенность. Наиболее чувствительны к ботулиническому токсину
лошади, у них болезнь чаще вызывается токсинами серовара В, реже
сероваров А и С. Крупный рогатый скот поражается токсинами сероваров С
и D, овцы и козы также чувствительны к токсинам С и D; у коз ботулизм
встречается чрезвычайно редко, но они очень чувствительны к токсину С.
Свиньи в естественных условиях проявляют к ботулизму значительную
устойчивость, однако экспериментально заболевание можно вызвать всеми
сероварами токсина, причем животные наиболее чувствительны к сероварам
В и F, известны случаи заболевания свиней, обусловленные токсином А.
Собаки, кошки, волки, кайоты, другие хищники, серые крысы резистентны к
заболеванию. Исключение составляют норки, которые проявляют высокую
94
чувствительность к ботулизму и поражаются чаще всего токсином серовара
С. Описан ботулизм песцов, черно-бурых лисиц и ондатр.
К ботулизму восприимчивы птицы, известно более 36 видов птиц, у
которых зарегистрирована эта болезнь, и среди них куры, индейки, утки,
гуси, чайки, голуби. Ботулизм у птиц вызывается преимущественно
токсинами сероваров С, А и В. Рыбы, амфибии и рептилии к ботулизму
практически невосприимчивы.
Восприимчив к ботулизму и человек, в качестве этиологических
факторов заболевания у человека обнаружены клостридий сероваров А, В и
Е.
Лабораторные животные (белые мыши, морские свинки и кролики)
восприимчивы к ботулиническим токсинам всех сероваров.
Патогенез. Ботулинический токсин в организм попадает с кормом, и
его удается обнаружить в тонком и толстом отделах кишечника, крови,
печени, желчи, моче, иногда в мозге. Особенно сильно при ботулизме
поражается центральная нервная система.
Из крови токсин проникает в органы, поражая нервные элементы.
Действуя на нейроны спинальных моторных центров и продолговатого
мозга, вызывает развитие паралитического синдрома; поражение же
периферических моторных нервно-мышечных приборов сопровождается
нарушением передачи возбуждения с нерва на мышцу. В больших дозах
токсин угнетает тканевое дыхание головного мозга, а также является
сосудистым ядом. Перед посевом культуру обязательно прогревают при
температуре 80 °С в течение 20 мин. Для выделения культуры можно сеять в
высокий столбик агара с глюкозой.
Лабораторная диагностика. Биологическое исследование
осуществляют для обнаружения ботулинических токсинов. Материал
растирают и разводят, как и в предыдущем случае, затем для
экстрагирования выдерживают при комнатной температуре 1-2 ч,
пропускают через ватно-марлевый фильтр, можно центрифугировать при
95
3000 об/мин 30 мин. Цитратную кровь и сыворотку не разводят, но
исследуют сразу после взятия: токсин в них разрушается очень быстро.
Для обнаружения токсина берут четырех белых мышей, по 16-18 г
каждая. Двум из них исследуемый материал (0,5-0,8 мл) вводят
внутрибрюшинно или внутривенно (в хвостовую вену), две другие остаются
контрольными (рис. 9). Им инокулируют предварительно прогретый в
течение 30 мин при температуре 100 °С экстракт. При наличии
ботулинического токсина две первые мыши гибнут через 1-4 дня,
контрольные остаются живы.
Рис. 9. Введение внутрибрюшинно или внутривенно (в хвостовую вену)
исследуемого материала для обнаружения токсина
Экстракты из исследуемого материала фильтруют и делят на две части,
одну из них прогревают 20-30 мин на водяной бане при 100
o
С. Заражают
фильтратом внутривенно или внутрибрюшинно двух белых мышей, морским
свинкам вводят экстракт фильтрата подкожно. При наличии токсина
ботулизма животные, зараженные некипяченым экстрактом фильтрата,
погибают на 2-5 день с характерными клиническими признаками.
Типизацию токсина проводят в реакции нейтрализации с
гомологичными антитоксическими сыворотками согласно прилагаемому к
ним наставлению.
При ботулизме иммунитет антитоксический. У восприимчивых
животных естественного иммунитета к ботулизму не существует. Описаны
случаи индивидуальной устойчивости к ботулиническому токсину людей и
96
животных. Перенесенное заболевание также не оставляет иммунитета ни у
человека, ни у животных.
В сыворотках здоровых людей и животных неоднократно
обнаруживали в высоких титрах агглютинины к антигенам клостридий
ботулизма. Эти антитела не проявляли защитного эффекта и, как
предполагают, возникали в результате скрытой иммунизации малыми дозами
спор, случайно попавшими с пищей и кормом.
3.3. ВОЗБУДИТЕЛЬ ЭМФИЗЕМАТОЗНОГО КАРБУНКУЛА
Эмфизематозный карбункул (эмкар) у крупного рогатого скота
вызывает С.
Cl. chauvoei. Впервые его обнаружил Фезер в 1865 г. в подкожной
клетчатке погибшей коровы. Поражаются преимущественно молодые
животные. Описаны редкие случаи заболевания буйволов, овец и коз.
Эмфизематозный карбункул - острая неконтагиозная инфекционная
болезнь, характеризующаяся развитием крепитирующих отеков в массивных
группах мышц, хромотой и быстрой гибелью животных.
Распространен почти во всех странах мира с развитым скотоводством,
встречается также и в нашей стране.
Морфология. Cl.chauvoei - прямые или слегка изогнутые с
закругленными концами палочки шириной 0,6-1,0 мкм и длиной 2-8 мкм. В
препаратах из тканей располагаются одиночно, парами, очень редко по 3-4,
нитей не образуют (рис.10).
Микроб обладает значительным полиморфизмом, особенно в мазках из
животных тканей, где нередко приобретает форму веретена, лимона, груши,
шара и т. д. Капсулы не имеет, подвижный (перитрих). В организме и
внешней среде образует центрально и субтерминально расположенную
спору. В культуре спорообразование отмечается через 24 ч, через 48 ч
становится значительным. Вегетативные клетки хорошо окрашиваются
спиртоводными растворами анилиновых красок, часто воспринимают
97
окраску неравномерно, более интенсивно на полюсах, в цитоплазме иногда
обнаруживают зернистость. По Граму в молодых культурах и препаратах из
тканей красятся положительно, в старых культурах - отрицательно.
Рис. 10. Cl.chauvoei Полиморфные, толстые палочки до 8 мкм
Культивирование. Cl.chauvoei - строгий анаэроб, требует создания
вакуума не менее 8-15 мм ртутного столба. В МПБ и на МПА даже с
добавлением глюкозы не растет. Для культивирования применяют
специальные среды, дополнительными ингредиентами которых являются
кровь, сыворотка, кусочки печени, мозга, мышц. Наиболее часто используют
среду Китта - Тароцци, бульон Мартена, мозговую среду, полужидкий агар,
глюкозо-кровяной агар, глюкозный агар с 10-12 % бычьей сыворотки.
Оптимальные значения рН 7,2-7,6, температуры 36-38 °С, рост возможен и
при 14 °С. В среде Китта - Тароцци уже через 12-24 ч дает пышный рост с
газообразованием и легким помутнением, на 2-3-й сут среда светлеет и на
дно выпадает рыхлый беловатый осадок, аналогично растет и в бульоне
Мартена. Молодые культуры запаха не издают, в старых обнаруживается
запах прогорклого масла. При росте в мозговой среде почернения не
наступает. В глубине сывороточного агара растет в форме чечевицеобразных
или круглых колоний с нежными отростками. На пластинке глюкозо-
98
кровяного агара Цейсслера через 24-48 ч инкубирования вырастают круглые,
в виде перламутровой пуговицы или в форме виноградного листа, плоские, с
ровным краем и приподнятым центром колонии, окруженные зоной
прозрачного гемолиза.
Биохимические свойства. Cl.chauvoei синтезирует протеазу, медленно
разжижающую желатин; свернутую сыворотку и яичный белок не
разжижает; коагулирует молоко на 3-6-е сут роста, сгусток его имеет вид
мягкой губчатой массы, пептонизация сгустка не наступает. Индол не
образует, большинство штаммов продуцируют незначительное количество
сероводорода, нитраты в нитриты не редуцируют. Ферменты каталазу и
лецитиназу не вырабатывает. Расщепляет с образованием кислоты и газа
глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, левулезу и не разлагает
маннит, салицин, глицерин, дульцит и инулин. Отношение, разных штаммов
к сахарам непостоянно, однако реакции на сахарозу и салицин являются
индикаторными: Cl.chauvoei в отличие от Cl.septicum ферментирует сахарозу
и не сбраживает салицин.
Токсинообразование. Возбудитель эмфизематозного карбункула
синтезирует и выделяет экзотоксин. Образование его происходит как в
организме, так и при выращивании микроба в жидких питательных средах. В
составе токсина обнаружены гемотоксический и некротизирующий
компоненты. Cl.chauvoei имеет общую летальную и некротизирующую
фракцию токсина альфа с Cl.septicum
, в то время как фракция альфа у
токсина возбудителя эмкара отсутствует. Поэтому антитоксическая
сыворотка
Cl.septicum инактивирует гомологичный токсин и токсин
Cl.chauvoei, антисыворотка же Cl.chauvoei нейтрализует только
гомологичный токсин.
Возбудитель эмкара обладает также ферментами патогенности. К ним
относятся дезоксирибонуклеаза (фактор бета), гиалуронидаза (фактор гамма),
токсическим компонентом является и фактор дельта - кислородолабильный
гемолизин; лецитиназу не содержит.
99
Токсин обладает антигенной функцией и при обработке формалином
переводится в анатоксин.
Антигенная структура. В составе антигенов возбудителя
эмфизематозного карбункула выделены термостабильный соматический Оантиген и термолабильный жгутиковый Н-антиген. Они обладают видовой
специфичностью и являются общими у всех штаммов. Однако имеются
наблюдения, что Н-антиген Cl.chauvoei, выделяемого от крупного рогатого
скота и овец, различен. Кроме того, дифференцирован споровый S-антиген,
общий с C.septicum
, что приводит к перекрестной агглютинации у этих двух
клостридий.
Устойчивость. Вегетативная форма Cl.chauvoei малоустойчива к
воздействию различных факторов внешней среды, споры же весьма
резистентны. В гниющих трупах споры сохраняются до 3 мес, в навозе с
примесью крови и остатками тканей - до 6 мес, а на дне водоемов
неблагополучных территорий - свыше 10 лет. В кислых почвах, бедных
органическими веществами, споры погибают значительно раньше. Имеются
предположения, что в почве споры сохраняют жизнеспособность до 20-25
лет. При соответствующих условиях в почве могут вегстировать и
размножаться. Споры Cl.chauvoei в гниющих мышцах погибают через 6 мес,
в высушенных мышцах выдерживают кипячение до 6 ч, а в свежем мясе - до
2 ч, в солонине сохраняются более 2 лет. В высушенном состоянии споры
теряют жизнеспособность при нагревании до температуры 100-105 °С за 2-12
мин, при 80 °С - через 2 ч, но не разрушаются текучим паром на протяжении
40-50 мин. Прямые солнечные лучи убивают их через 24 ч.
На споры возбудителя губительно действует 3 %-ный раствор
формалина в течение 10-15 мин, 3 %-ный фенол действует слабо. В 6 %-ном
растворе гидроокиси натрия они погибают через 6-7 дней, в 12 %-ном
растворе - через 24 ч и в 25 %-ном - через 14 ч, но в подогретом до 40 ° С через 50 мин.
100
Растворимый токсин, синтезируемый микробом при росте в жидких
средах, разрушается при 60 °С в течение 4 ч; токсин, связанный с
бактериальными клетками, более резистентный: при 60
0
С через 10 ч не
происходит его разрушения.
Патогенность. В естественных условиях преимущественно более
крупный рогатый скот и овцы. Редкие случаи заболевания наблюдают у коз,
буйволов, оленей и лосей. Cl.chauvoei был также выделен из трупов норок
как возбудитель кормового отравления.
Наиболее восприимчив молодняк крупного рогатого скота в возрасте
от 3 мес до 4 лет. Животные старше 4 лет резистентны за счет
иммунизирующей субинфекции, телята до 3-месячного возраста - благодаря
колостральному иммунитету. Однако изредка отмечались заболевания телят
3-дневного возраста и скота в возрасте 10-12 лет. Племенные животные,
особенно мясных пород, более восприимчивы, чем степной и рабочий скот.
Независимо от породы повышенной чувствительностью обладают упитанные
животные: их мышечная ткань содержит больше гликогена, необходимого
для развития микроба.
Лошади и ослы невосприимчивы, отмечали отдельные случаи болезни
у свиней. Верблюды в естественных условиях не болеют, искусственно же их
заразить удавалось. Собаки и кошки невосприимчивы. Человек к
возбудителю эмфизематозного карбункула практически невосприимчив.
Из лабораторных животных наиболее восприимчивы морские свинки,
они гибнут через 16-48 ч с момента заражения.
Патогенез. Заражение происходит при попадании спор в
пищеварительный тракт с кормом и питьевой водой. Проникновению спор
благоприятствуют травмы слизистой оболочки, в том числе и микротравмы.
Личинки оводов, мигрируя из пищеварительного канала в мышцы,
способствуют внедрению возбудителя эмфизематозного карбункула и
создают условия для его размножения. Возбудитель может проникать также
через ранки на поверхности тела, среди которых важная роль отводится