Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Патогенные анаэробы рода Clostridium в ветеринарной медицине. Учебное пособие для студентов ветеринарного факультета.pdf
31
анаэробную дизентерию и энтеротоксимию у молодняка животных,
энтеротоксимию у овец, является одним из возбудителей газовой анаэробной
инфекции у животных и людей, некоторые серологические варианты (А и С)
способны вызывать пищевые токсикоинфекции.
Сl. perfringens легко культивируются на простых питательных средах,
но обязательно с добавлением сахара как источника энергии. Они обладают
слабыми протеолитическими свойствами, но имеют большой набор
сахаролитических ферментов, сбраживающих сахара с образованием кислоты
и газа. Эти микробы вызывают быстрое свертывание молока (в течение 2-5 ч)
с образованием губчатого сгустка, «подбрасываемого» к ватной пробке
пробирки за счет газообразования, и прозрачной сыворотки.
Большим преимуществом Сl. perfringens перед кишечными палочками
как санитарно-показательными микроорганизмами является быстрая и
технически несложная индикация их в окружающей среде, не требующая
последующей идентификации. При посеве материала исследуемых объектов
(почвы, пищевых продуктов, перевязочных материалов и т. п.) на среду
Вильсона - Блера, молоко, сульфит-неомицинполимиксиновую среду (СНП,
предложенную Г. И. Сидоренко, ТО. П. Пивоваровым в 1968 г.) уже через 812 ч инкубации в термостате при температуре 45°С можно получить ответ о
присутствии клостридий. Только в исключительных случаях выделяется
чистая культура для детального изучения. Незаменимы Сl. perfringens как
показатели загрязнения пищевых продуктов и почвы в том случае, когда они
определяются с целью обнаружения других патогенных клостридий возбудителей ботулизма и столбняка.
Против использования Cl. perfringens как санитарно-показательных
микроорганизмов есть два возражения: во-первых, они способны
образовывать споры и, следовательно, длительно сохраняться в объектах
окружающей среды, во-вторых, возможно их размножение в почве и других
объектах. Исследованиями последних лет было доказано, что в почве
имеются токсические вещества, выделяемые микробами-антагонистами,
32
которые способствуют гибели анаэробов, в равной степени действуя на
вегетативные тела клостридий и их споры. Кроме того, для прорастания спор
клостридий нужны толчок в виде «теплового» шока (нагревание до 70°С в
течение 30 мин) и температура не ниже 18-20°С.
Недостатками Сl. perfringens, как СПМ является и тот факт, что они не
всегда присутствуют в кишечнике человека. У детей до 3-х лет ее выделяют
лишь в 38% случаях в титрах 102-103/г; у взрослых в 70-98% случаев в титрах
108. Однако если принять во внимание наличие в кишечнике животных и
людей других клостридий, то Сl. perfringens с полным правом может
претендовать на роль СПМ.
Обнаружение Сl. perfringens в определенном титре в окружающей
среде свидетельствует о старом фекальном загрязнении, так как Сl.
perfringens длительно сохраняются во внешней среде за счёт
споробразования. Однако если количество их велико и они обнаруживаются
вместе с БГКП, то это говорит о свежем фекальном загрязнении.
В настоящее время о давности фекального загрязнения принято судить
по сопоставлению количества споровых и вегетативных форм Сl. perfringens.
С этой целью определяют количество клостридий в непрогретых и прогретых
пробах. В свежих фекалиях 80-100% клостридий представлены
вегетативными клетками. Этот метод предложен в нашей стране в 1976 году.
С 1958 года за рубежом предложен другой метод обнаружения
давности фекального загрязнения по наличию Сl. perfringens. Клостридий,
сравнительно недавно попавших во внешнюю среду, условно обозначают
“фекальными”, а попавшими давно – “почвенными”. Конечно такое
разделение носит условный характер, так как все С. perfringens имеют
фекальное происхождение. Тем не менее “почвенные” Сl. perfringens
устойчивы к воздействию 20%-ного раствора хлорида натрия, а “фекальные”
– лабильны. Дифференциацию “почвенных” и “фекальных” штаммов
проводят посевом на среду с полимексином и неомицином после 10-часового
инкубирования в 20% растворе хлорида натрия при 4°С. Этот метод в нашей
33
стране недостаточно апробирован.
В отечественной практике о давности фекального загрязнения судят по
сопоставлению коли-индекса и индекса Сl. perfringens. Высокое значение
коли- и низкое перфрингенс-индекса указывает на давнее загрязнение. Если
оба показателя имеют высокое значение, это свидетельствует о свежем
фекальном загрязнении.
Несомненно, должна проверяться на присутствие Сl. perfringens вода,
подаваемая на предприятия консервной промышленности, в производстве
которых нахождение в воде клостридий особенно опасно. Поэтому строго
нормируется и контролируется их количество: в объеме 100 мл воды не
должна обнаруживаться ни одна особь клостридий.
В ряде стран (США, Англия, Франция) клостридий включены в
стандарты качества воды как дополнительный показатель.
При выборе нового источника водоснабжения, по Международным
стандартам качества питьевой воды, считается обязательным определение
перфрингенс-титра как показателя возможного присутствия патогенных
клостридий. Определение Сl. perfringens проводят в некоторых пищевых
продуктах, но уже как возбудителя пищевых отравлений. Критический
уровень этих микроорганизмов в готовых блюдах равен 10 клеток в 1 мл или
1 г продукта. Для колбас разрешается использовать мясо содержащее не
более 100 клеток Сl. perfringensв 1 г; в консервах до стерелизации должно
быть не более 1000 клеток/г, так как в такой концентрации при
автоклавировании они погибают. Готовые консервы не должны содержать Сl.
perfringens
Особенности выявления и идентификации сульфитредуцирующих клостридий в санитарной микробиологии
Определение сульфитредуцирующих клостридий в санитарной
микробиологии проводят, как правило, руководствуясь следующими
документами:
34
ГОСТ 10444.9—88 Продукты пищевые Метод определения
Clostridium perfringens.
ГОСТ 29185—91 Продукты пищевые. Методы выявления и
определения количества сульфитредуцирующих клостридий;
ГОСТ 7702.2.6—93 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты
птичьи. Методы выявления и определения количества
сульфитредуцирующих клостридий.
ГОСТ 30425—97 Консервы. Методы определения промышленной
стерильности.
35
Блок 2. Пищевые отравления, вызванные анаэробными бактериями рода Clostridium
2.1. Пищевые отравления, вызванные бактериями Clostridium
perfringens.
Микроорганизмами — возбудителями этого заболевания являются
грамположительные, анаэробные спорообразующие палочковидные
бактерии, широко распространенные в природе. На основании их
способности производить определенные экзотоксины различают пять разных
типов штаммов: A, B, C, D и E. Штаммы, вызывающие пищевые отравления,
принадлежат к типу A, так же как и штаммы, которые являются
возбудителями классической газовой гангрены. Однако в отличие от этих
последних штаммы, вызывающие собственно пищевые отравления, являются
термоустойчивыми и производят только лишь следовые количества альфатоксина. Некоторые штаммы, относящиеся к типу С, продуцируют
энтеротоксин и могут вызвать синдром пищевого отравления. Классические
штаммы, вызывающие пищевые отравления, отличаются от штаммов типа С
тем, что не продуцируют бета-токсин. Последние, которые были выделены из
некротизированных очагов поражения при энтерите, сравниваются с
термочувствительными и термоустойчивыми штаммами, принадлежащими к
типу A. Термоустойчивые штаммы типа A продуцируют тета - токсин,
который является перфринголизином O (PLO) — тиолактивируемым
гемолизином, похожим на листериолизин O (LLO), который продуцируется
бактериями Listeria monocytogenes. Так же как и LLO, перфринголизин O
обладает молекулярным весом в 60 кДа. Токсин был секвенирован и
клонирован.
Несмотря на то что Cl. perfringens ассоциировали с заболеваниями
гастроэнтеритом с 1895 г., первая доказательная демонстрация
этиологического статуса этих организмов при пищевых отравлениях была
представлена McClung в 1945 году, который исследовал четыре массовые
36
вспышки пищевых отравлений, вызванных мясом кур. Первое детальное
описание характеристик этого синдрома пищевого отравления было
представлено в работе Hobbs и др. (1976), в Великобритании. Несмотря на то
что британские исследователи были к тому времени (в 1940–1950-х гг.)
достаточно хорошо осведомлены об этих бактериях как возбудителях,
вызывающих пищевые отравления, в США до 1960 г. практически не было
зарегистрировано случаев таких заболеваний. Сейчас стало очевидным, что
пищевые отравления, вызываемые бактериями Cl. perfringens, чрезвычайно
широко распространены во многих странах и континентах.
Распространение бактерий C lostridium perfringens
Штаммы Cl. perfringens, вызывающие пищевые отравления,
обнаруживаются в почве, воде, пыли, продуктах питания, пряностях и в
пищеварительных трактах человека и животных. Многие исследователи
сообщали, что распространенность термоустойчивых, не гемолитических
штаммов в общей популяции оценивается в пределах от 2 до 6%. В
экскрементах от 20 до 30% здорового персонала больниц и членов их семей
были обнаружены эти организмы, а среди заболевших процент носителей
этих токсигенных клостридий через две недели равнялся 50%, а иногда
достигал и 88%. Термочувствительные штаммы являются обычными
представителями микрофлоры желудочно-кишечного тракта у всех людей.
Бактерии Cl. perfringens попадают в мясо либо непосредственно после забоя
животных, либо в результате последующего заражения мяса животных
руками людей или пылью. Поскольку клостридии являются
спорообразующими бактериями, они могут противостоять неблагоприятным
условиям среды, высушиванию, нагреванию и воздействию различных
токсических веществ.
Характеристика бактерий Clostridium perfringens по показателям
устойчивости
Штаммы Cl. perfringens, вызывающие пищевые отравления, так же как
и многие другие штаммы этого вида, хорошо растут на самых различных
37
средах при их инкубации в анаэробных условиях или в случае появления у
них дополнительной восстанавливающей способности. Выделенные из
мышечной ткани лошадей штаммы Cl. perfringens, при значении
окислительно-восстановительного потенциала (Eh), равном – 45 или ниже,
росли без большого лаг-периода, тогда как при более положительных
значениях Eh длительность лаг-фазы увеличивалась. Несмотря на то что
получить рост этих бактерий несложно на самых различных средах,
споруляция требует использования специальных сред, как описано в работе
Duncan и Strong (1968), или специальной техники, как, например, диализных
мешков.
Бактерии C1. perfringens являются мезофиллами с оптимальными
0
температурами роста в пределах от 20 до 50
С. Показано, что оптимальными
температурами роста на тиогликолатной среде для шести штаммов является
диапазон от 30 до 40
оптимальными температурами были 37–40
0
С, а для споруляции при росте на среде Эллнера
0
С. Время генерации
спорообразования, когда культивирование этих штаммов осуществлялось
о
при температуре 45
С (при прочих оптимальных условиях), составляло всего
7 мин. Что касается рН, то многие штаммы обычно растут в пределах 5,5–8,0
и, как правило, не ниже 5,0 и не выше 8,5. Наиболее низкими из
сообщавшихся значений активности воды ("a", "w" ), допускающих рост и
созревание спор, являются 0,97 и 0,95 при добавлении сахарозы или NaCl
либо примерно 0,93 в присутствии глицерин анатиогликолатной среде.
Образование спор требует, по-видимому, более высоких значений "a" "w" ,
чем минимальные, обозначенные выше. Несмотря на то что Labbe и Duncan
[1974] продемонстрировали рост бактерий, принадлежащих к штаммам типа
A, при рН равном 5,5, при этом не наблюдалось ни спорообразования, ни
продукции токсина. Значение рН, равное 8,5, является, по-видимому,
наибольшим для роста.
Бактерии Cl. perfringens не являются такими строгими анаэробами, как
некоторые другие клостридии. Так, например, наблюдали рост этих бактерий
38
при начальном значении Eh, равном +320 мВ. Для роста этих клостридий
необходимо присутствие в среде 13 аминокислот, а также биотина,
пантотеновой кислоты, пиридоксина, аденина и других соединений. Они
являются гетероферментативными и способны разлагать большое количество
самых разнообразных углеводов. Рост ингибируется в присутствии 5% NaCl.
Эндоспоры у вызывающих пищевые отравления штаммов бактерий
различаются по степени устойчивости к температуре. Некоторые из них
являются типичными среди других мезофильных, спорообразующих
бактерий, другие же отличаются повышенной устойчивостью. Сообщалось о
том, что для штамма Cl. pe rfringens ATCC 3624 значение D 100 равно 0,31, а
для штамма NCTC 8238 это значение равно 17,6. Для восьми штаммов,
которые вызывали реакцию у кроликов, значения D 100 оценивались в
пределах от 0,70 до 38,37, в то время как штаммы, не вызывавшие реакцию у
кроликов, были гораздо более термоустойчивыми. Различия в степени
устойчивости к температуре среди штаммов C1. perfringens связаны с
присутствием гена cpe. Значения D 100 для 13 изолятов, выделенных из
зараженных мяса, птицы и рыбы, в которых ген cpe имел хромосомную
локализацию, оценивались впределах от 43 до 170. В тоже время штаммы,
выделенные не из очагов массового заражения, в которых ген cpe был
локализована в плазмиде. Несколько исследовательских групп изучали
разрушение вегетативных клеток Cl. perfringens, живущих в приготовленных
жареных и вареных продуктах, при длительном нагревании и невысокой
температуре. Значение D 56, для штамма C. perfringens ATCC 13124 при
автоклавировании мясного фарша было равно 48,3 мин, что в основном
совпадает со значениями D 56 или D 47 для фосфолипазы С. При изучении
штамма NCTC 8798 было показано, что значение D для вегетативных клеток,
живущих в мясном фарше, повышалось при повышении температур роста.
Для клеток, растущих при 37, значение D 59 было 3,1 мин. Для клеток,
о
растущих при 45
о
С, имели D 59, равное 10,6 мин. Несмотря на то что уже упоминавшиеся
49
С, значение D 59 было 7,2 мин, а клетки, растущие при
39
достаточно большие различия в термоустойчивости между двумя разными
штаммами могут быть отчасти за счет разницы штаммов, нельзя забывать и
фактор присутствия жира в нагреваемом растворе, что также играет
определенную роль в термоустойчивости. При подогревании жареной
говядины в пластиковых пакетах на водяной бане при температурах в
пределах 60–61
о
С, выдерживание продукта по крайней мере 12 мин
полностью уничтожало сальмонелл и снижало численность популяции Cl.
perfringens примерно на три логарифмических цикла. Для достижения
эффекта снижения численности популяции Cl. perfringens на 12
логарифмических циклов для жареной говядины весом 1,5 кг необходимо
о
проводить подогревание при 60
термической деструкции при 61
С в течение 2,3 ч или более. Для
о
С энтеротоксина C. perfringens в буферном
ра-ре или соке, выделяемом из мяса при жаренье и тушении, необходимо
соответственно 25,4 и 23,8 мин.
У бактерии Cl. perfringens установлена довольно широкая
вариабельность термоустойчивости. Условия среды микроокружения в
организме настолько разнообразны, что можно ожидать значительной
вариабельности среди штаммов бактерий. Еще одним очень важным
фактором, влияющим на термоустойчивость бактериальных спор, является
химический состав окружающей среды. Alderton и Snell (1964) установили,
что термоустойчивость спор является индуцибельной характеристикой и
существует некое обратимое равновесие между устойчивым к температуре и
чувствительным состояниями. Эта гипотеза была использована в
дальнейшем, как основополагающая и было показано, что можно повышать
термоустойчивость спор при обработке раствором ацетата кальция, например
0,1–0,5-молярным при рН, равном 8,5, в течение 140 ч при температуре 50
о
С.
С помощью этого метода термоустойчивость эндоспор может быть
повышена в пять–десять раз. С другой стороны, термоустойчивость может
быть и понижена при выдерживании эндоспор в 0,1 N соляной кислоте при
о
25
С в течение 16 ч или в результате выдерживания эндоспор в естественных
40
условиях кислой среды или в каком-либо продукте с повышенной
кислотностью. После получения таких результатов исследований не кажется
столь уж невероятным, что высокая степень вариабельности
термоустойчивости эндоспор бактерий Cl. pe rfringens может быть более или
менее прямым результатом только что произошедших изменений в
окружающей среде. Strong и Canada [1964] изучали процесс выживания
бактерий Cl. perfringens в условиях замораживания в куриной подливке и
установили, что при замораживании и хранении при –17,7оС в течение 180
дней выживало только около 4% бактерий. С другой стороны, высушенные
споры демонстрировали уровень выживаемости в этих условиях порядка 40%
после 90 дней хранения, но только 11% при хранении в течение 180 дней.
Для эпидемиологических исследований делались попытки применения
метода серотипирования, однако из-за наличия большого количества
различных сероваров не удалось установить согласуемых взаимосвязей
между очагами массового заражения и известными сероварами. Было
проведено также типирование штаммов по бактериоцинам среди бактерий Cl.
perfringens, относящихся к типу A, и было обнаружено 90 штаммов в очагах
массового заражения. Все эти штаммы были типированы и 85,6% из них
содержали бактериоцины типов 1–6.
Энтеротоксин.
Энтеротоксин является фактором, определяющим пищевые отравления
при попадании бактерий Cl. perfringens в организме человека и животных.
Необычным является то, что этот белок является споро-специфическим; его
выделение происходит параллельно с процессом споруляции. Причиной всех
известных случаев пищевых отравлений, вызванных этим видом бактерий,
были штаммы, относящиеся к типу A. Другое заболевание, некротический
энтерит, вызывается бета-токсином, производимым штаммами типа С.
Несмотря на то что некротический энтерит, вызываемый клостридиями типа
С, связан с уровнем смертности в 35–40%, пищевые отравления, вызываемые
клостридиями типа A, являются фатальными только для пожилых и