Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Патогенные анаэробы рода Clostridium в ветеринарной медицине. Учебное пособие для студентов ветеринарного факультета.pdf
81
Рис.4. Морфология C. tetani.
Культивирование. Возбудитель столбняка - строгий анаэроб, на
поверхности плотных питательных сред растет при остаточном давлении не
выше 4-5 мм ртутного столба. Оптимальными являются рН 7,4-7,6 и
температура 36-38
Cl.tetani
может развиваться и в условиях без особой защиты от
0
С, границы роста лежат в пределах 14-43 0С.
атмосферного кислорода, если в составе среды имеются редуцирующие
вещества: 0,2-1,0% глюкозы, 0,3% муравьинокислого натрия, кусочки мышц.
Этот микроб для роста требует наличия в среде в качестве донаторов
водорода аминокислот: аргинина, гистидина, тирозина, валина, изолейцина и
триптофана.
На среде Китта - Тароцци растет медленно, обычно через 24-36 ч
появляется интенсивное равномерное помутнение с незначительным
газообразованием в виде единичных пузырьков, к 5-7 сут выпадает рыхлый
осадок, среда при этом становится прозрачной. Культуры, особенно к 3-5 сут
роста, издают своеобразный запах жженого рога.
На глюкозо-кровяном агаре в анаэробных условиях образует нежные
беловато-серые колонии с отростками и приподнятым центром, иногда они
бывают мелкими круглыми и напоминают капельки росы. Колонии
окружены слабой зоной гемолиза (2-4 мм) (рис. 5).
82
Рис.5.
На глюкозо-кровяном МПА – нежный налет с периферическими
отростками, вокруг колоний гемолиз
Если чашки дополнительно выдержать при комнатной температуре,
зона гемолиза увеличится, при обильном посеве гемолиз может быть по всей
поверхности среды. В высоком столбике агара через 1-2 суток и вырастают
плотные колонии, напоминающие чечевичное зерно, иногда диск (R-форма)
или же пушинку с плотным центром (S-форма). В столбике желатина через 512 дней появляется рост в виде елочки и происходит медленное разжижение
субстрата. Молоко свертывается медленно с образованием на 5-7-е сутки
мелких хлопьев, мозговая среда чернеет через очень продолжительное время.
Биохимические свойства. В отличие от других патогенных
клостридий возбудитель столбняка характеризуется слабой биохимической
активностью. Этот микроб не сбраживает моносахариды и многоатомные
спирты. Однако некоторые штаммы могут ферментировать глюкозу. Данная
их особенность находится в прямой зависимости от концентрации в среде
ионов железа.
Cl.tetani вырабатывает две протеазы, но обладает слабыми
протеолитическими свойствами, вызывая медленную ферментацию
протеинов и пептонов до аминокислот, которые затем разлагаются с
образованием угольной кислоты, водорода, аммиака, летучих кислот и
индола.
83
Токсинообразование. Возбудитель столбняка лишен факторов
инвазивности, но обладает способностью синтезировать экзотоксин высокой
активности. Столбнячный токсин получен и описан в 1890 г. Берингом и
Китазато. С этим токсином связана вся специфика патогенеза и клинической
картины столбняка.
В составе стобнячного экозотоксина два компонента - тетаноспазмин и
тетанолизин (тетаногемолизин). Первый избирательно действует на нервную
систему и вызывает тонические сокращения поперечнополосатых мышц,
второй - неспецифический гемолиз эритроцитов.
Основным токсическим фактором этого микроба является те-
таноспазмин, выполняющий функцию нейротоксина, поражающего
моторные нейроны центральной нервной системы. Цитопатический эффект в
отношении клеток других тканей не проявляет. Он вырабатывается в
организме и культурах, появляясь на 2-е сут инкубирования и достигая
максимума к 5-7-му дню. Очищенный кристаллизованный тетаноспазмин термолабильная протеаза, состоящая из 13 аминокислот с количественным
преобладанием аспарагина. Токсичность кристаллического тетаноспазмина
составляет 6 6х10
6
ЛД50 для белых мышей на 1 мг азота токсина.
Тетанолизин - разрушающийся в присутствии кислорода гемолизин,
имеющий общие свойства с тета-токсином Cl.perfringens, пневмолизином
пневмококков и О-стрептолизином гемолитических стрептококков. В
культурной жидкости накапливается в значительном количестве уже через
20-30 ч, в старых культурах разрушается. Обладает гемолитическим,
кардиотоксическим и летальным действиями.
Процессы образования тетаноспазмина и тетанолизина взаимно не
обусловлены: имеются штаммы, продуцирующие большое количество
тетанолизина и малое количество тетаноспазмина.
Экзотоксин возбудителя столбняка нестоек и легко разрушается при
высокой температуре (при 60 °С - через 30 мин, при 65
0
С - через 5 мин), а
также при действии прямых солнечных лучей, ионизирующих излучений,
84
перманганата калия, азотнокислого серебра, йода, кислот, щелочей.
Антибиотики и сульфаниламиды не разрушают этот токсин. Он не проникает
через стенку кишечника и не инактивируется ферментами желудочнокишечного тракта. Под воздействием формалина при температуре 35-38 °С
переходит в анатоксин - нетоксический иммуногенный препарат.
К ферментам патогенности клостридий столбняка следует отнести
РНК-азу и фибринолизин. РНК-аза токсична для лейкоцитов и ингибирует
фагоцитоз; фибринолизин способствует всасыванию тетаноспазмина.
Антигенная структура. Подвижные штаммы клостридий столбняка в
своем составе имеют соматический О- и жгутиковый Н-антигены,
неподвижный - только О-антиген. Термолабильный Н-антиген определяет
типовую специфичность микроба. Описано 10 сероваров возбудителя
столбняка, различающихся по структуре Н-антигсна, обозначаемых цифрами
I, II, III, IV и т. д. В природе чаще других встречают серовары I и II. Все они
продуцируют иммунологически однородный экзотоксин, нейтрализуемый
противостолбнячной сывороткой. Термостабильный О-антиген является
групповым.
Антигенная структура столбнячного токсина изучена недостаточно.
Принято считать, что токсины различных штаммов имеют одинаковую
иммунологическую структуру.
Устойчивость. Вегетативные клетки Cl.tetani малоустойчивы к
воздействию различных факторов внешней среды. Температура 60-70
0
С
убивает столбнячные палочки в течение 30 мин, растворами обычных
дезинфицирующих препаратов они обезвреживаются через 15-20 мин.
Споры, напротив, весьма резистентны. В почве, высохшем кале, на
различных предметах (гвозди, щепки, сельскохозяйственные орудия,
колючки растений), защищенных от света, они сохраняются в течение
многих лет (так, например, на кусочке сухого дерева - до 11 лет). Прямой
солнечный свет инактивирует споры через 3-5 сут. Во влажной среде при
нагревании до 80 °С сохраняют жизнеспособность 6 ч, а при нагревании до
85
90 °С - 2 ч. При кипячении споры погибают через 30-50 мин, сухой жар при
температуре 115
0
С разрушает их только через 20 мин. Они также
относительно устойчивы к различным дезинфектантам: 1 %-ный раствор
сулемы и 5 %-ный раствор фенола убивают их через 8-10 ч, 5 %-ный раствор
креолина - за 5, 1 %-ный раствор формалина - за 6 ч, 0,5 %-ный раствор
соляной кислоты - за 30 мин, 10 %-ная настойка йода - за 10, 1 %-ный
раствор азотнокислого серебра - за 1 мин.
Патогенность. К столбняку восприимчивы все виды
сельскохозяйственных животных и люди. Среди них наиболее чувствительны
лошади. Болеют также собаки, кошки и дикие млекопитающие. В литературе
описаны случаи столбняка кур, гусей и индюков. К токсину возбудителя
столбняка исключительно восприимчив человек. Холоднокровные - лягушки,
змеи, черепахи, крокодилы - невосприимчивы к столбняку при температуре
ниже 20
0
С, но введенный токсин длительное время циркулирует в их
организме.
Из лабораторных животных наиболее восприимчивы белые мыши,
морские свинки и кролики. Инкубационный период у белых мышей
продолжается до 36 ч, у морских свинок - до 48 ч, у кроликов - до 3-4 дней.
Заболевание у них развивается по типу общего или восходящего (tetanus
ascendes) столбняка.
Рис. 6. Белым мышам или морским свинкам - вводят экстракт исследуемого
материала подкожно в заднюю лапку двум-трем животным. При наличии токсина через 24 сут. у животных наблюдают тетанические судороги и гибель.
86
Особенно характерно клиническая картина проявляется у белых
мышей. У них отмечается ригидность хвоста и инокулированной лапки.
Конечность вытянута, ограничена в подвижности, туловище искривлено в
сторону инокулированной лапки, постепенно процесс захватывает вторую
половину тела, положенная на спину мышь не может самостоятельно
перевернуться. Погибающие животные принимают характерную позу с
искривлением тела и вытянутыми лапками (рис. 6). Гибель их наступает в
сроки от 12 ч до 5 сут.
Патогенез. Ведущая патогенетическая роль при столбняке
принадлежит экзотоксину, и в первую очередь тетаноспазмину,
являющемуся нейротоксином. Он не поражает кожу и не оказывает
цитотоксического действия. Ферменты протеазы и фибринолизин,
расплавляя кровяные сгустки и тромбы, способствуют распространению
токсина за пределы очага размножения микробов.
При ранении споры в условиях анаэробиоза быстро вегетируют,
происходит интенсивное размножение бактерий и синтез токсина.
Экзотоксин поражает двигательные нервные центры, спинной и
головной мозг, что в конечном итоге и определяет основной
симптомокомплекс столбняка. Под влиянием токсина снижается активность
холинэстеразы и соответственно гидролиз ацетилхолина, неизбежно ведущий
к избыточному его образованию, вследствие чего концевая пластинка
нервно-мышечного синапса приходит в состояние повышенного
автоматического возбуждения. Судороги приводят к расстройству внешнего
дыхания, развивается ларинготрахеоспазм, наступает гипоксия,
респираторный и метаболический ацидоз. Под действием избыточного
количества молочной кислоты может развиваться отек мозга. Животные
погибают в результате асфиксии или паралича сердца.
Лабораторная диагностика. В лабораторию для исследования
направляют кусочки тканей из глубоких слоев раневых поражений, гной,
инородные тела, тампоны, перевязочный материал, содержащий выделения
87
из ран, в котором могут находиться клостридий столбняка. При
генерализации процесса возбудителя обнаруживают во внутренних органах.
В этом случае берут от трупа кусочки печени и селезенки по 20-30 г и 10 мл
крови.
При возникновении столбняка после родов или аборта направляют
выделения из влагалища и матки, а при подозрении столбняка у
новорожденных животных посылают труп целиком.
При исследовании выделяют возбудителя столбняка и его токсин.
Мазки окрашивают по Граму. Наличие в препаратах
грамположительных палочек с круглыми терминальными спорами дает
основание подозревать столбняк. Однако нередко находят сапрофитные
бактерии (Cl. tetanomorphum и Cl. putrificum), очень похожие на клостридий
столбняка. Поэтому микроскопия имеет только ориентировочное значение.
Материал засевают на среду Китта - Тароцци. Культуру
микроскопируют и, если она загрязнена, прогревают 20 мин при температуре
80 °С или 2-3 мин при 100
0
С. Затем производят пересев методом
фракционирования на чашки Петри с глюкозо-кровяным агаром и посевы
выращивают в анаэробных условиях. После получения роста отбирают
характерные колонии и для выделения чистой культуры производят отсев.
Биопробу проводят для обнаружения токсина в патологическом
материале и культуре. Исследуемый материал растирают в стерильной
ступке с кварцевым песком, добавляют двойной объем физиологического
раствора. Смесь выдерживают 60 мин при комнатной температуре, после
чего фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр и вводят
фильтрат внутримышечно в бедро задней лапки двум мышам в дозе 0,5-1 мл.
Для получения более быстрого результата рекомендуют вводить материал в
область корня хвоста в смеси с хлористым кальцием или стерильным
порошком пемзы. Для пассивной иммунизации и лечения больных животных
предложена антитоксическая противостолбнячная сыворотка. Ее получают
путем гипериммунизации столбнячным анатоксином лошадей.
88
Если исследуют культуру, то для накопления токсина ее
предварительно выдерживают при температуре 37-38 °С в термостате 6-10
дней, фильтруют или центрифугируют и вводят в дозе 0,3-0,5 мл двум белым
мышам.
Биопробу можно проводить и на морских свинках. Животные погибают
обычно в срок от 12 ч до 5 сут. Наблюдают за подопытными животными не
менее 10 дней.
Столбнячный токсин в культурах может быть обнаружен и при помощи
серологических реакций.
У животных некоторых видов отмечается естественная устойчивость к
столбняку. Известно, что крупный рогатый скот и свиньи болеют реже, чем
другие животные. Предполагают, что у них с кормом происходит
поступление спор возбудителя столбняка, которые вегетируют в
пищеварительном тракте, и образуется токсин, всасывающийся в очень
небольших количествах и вызывающий иммунитет. В нативных сыворотках
коров, зебу, буйволов, баранов обнаруживают столбнячный антитоксин, в
меньшем количестве его находят в сыворотках лошадей и верблюдов.
Принято считать, что иммунитет при столбняке в основном
антитоксический.
3.2. ВОЗБУДИТЕЛЬ БОТУЛИЗМА ЖИВОТНЫХ
Возбудитель ботулизма - Cl. botulinum вызывает остропротскающий
кормовой токсикоз. Заболевание развивается вследствие воздействия
ботулинического токсина на организм, характеризуется поражением
центральной нервной системы и сопровождается парезами двигательных
мышц.
Ботулизм описан в середине XVIII в., его название связано с первым
наблюдением заболевания у людей, развившегося в результате употребления
в пищу кровяной колбасы (лат. bolulus - колбаса). Возбудитель же был
89
открыт в 1896 г. ван Эрмснгсмом, который выделил его из зараженной
ветчины, а также селезенки человека, погибшего от ботулизма.
Дальнейшее изучение показало, что в природе существует семь
сероваров Cl. botulinum (А, В, С, D, Е, F и G), которые различаются по
антигенной структуре экзотоксинов.
Морфология. Cl. botulinum в окрашенных препаратах иммет вид
палочек с закругленными концами длиной 4-9 и шириной 0,6-0,8 мкм.
Бактерии располагаются изолированно или парами, иногда в виде коротких
цепочек. Микроб подвижен, большинство клеток из старых культур без
жгутиков. Образует споры, располагающиеся субтерминально, редко
центрально. Палочки со спорами имеют вид теннисных ракеток. Капсулы не
образуют (рис. 7).
Рис. 7. Морфология Clostridium botulinum
Вегетативные клетки хорошо окрашиваются спиртоводными
растворами анилиновых красок, грамположитсльные в молодых культурах и
на препаратах из тканей, в старых культурах - грамотрицательные.
Культивирование. Возбудители ботулизма - строгие анаэробы. На
поверхности плотных питательных сред растут при условии, если остаточное
давление воздуха не превышает 3-6 мм ртутного столба. Для
культивирования применяют специальные среды: глюкозокровяной агар
Цсйсслера, печеночный агар с глюкозой, агар столбиком с глюкозой, среду
Китта - Тароцци, бульон Хоттингера под вазелиновым маслом с кусочками
90
мяса или печени и добавлением непосредственно перед посевом 0,5-1 %
глюкозы. На сахарном кровяном МПА – колонии в виде “перламутровой”
пуговицы, узкая зона гемолиза (рис 8).
Оптимальная температура для роста и токсинообразования бактерий
0
сероваров А, В, С, D - 35 °С, для сероваров Е и F - 28-30
С; споры
возбудителей ботулизма сероваров Е и F могут прорастать, размножаться и
образовывать токсин даже при 4 °С, развитие и токсинообразованис
сероваров А и В возможно при температуре 10-55 °С. Оптимум рН 7,4-7,7.
На среде Китта - Тароцци образует помутнение, затем появляется
осадок и жидкость светлеет, культура издает запах прогорклого масла.
Рис. 8. На сахарном кровяном МПА – колонии в виде “перламутровой”
пуговицы, узкая зона гемолиза
На агаре Цейсслера вырастают прозрачные колонии - росинки
величиной в несколько миллиметров с ровными или изрезанными краями и
блестящей поверхностью, окруженные зоной гемолиза. Окрашены колонии в
слегка коричневатый или серовато-мутный цвет, их середина вогнутая или
выпуклая. Крупные колонии более плоские. В пределах одного штамма
встречаются колонии нескольких типов. Одни штаммы дают полный
гемолиз, другие только обесцвечивают агар. В агаре столбиком колонии
имеют форму чечевиц или комочков ваты с уплотненным центром.