Природные антиоксиданты (экологический аспект). Монография
.pdf
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
В настоящее время выяснено, что доля энергии, поглощаемая антоцианами, зависит от распределения последних в толще листовой пластинки. При равномерном распределении они поглощают 10—26 %, а при сосредоточенности в нижнем эпидермисе — до 6 % общего поглощения. Имеются данные о том, что антоциансодержащие растения клещевины, капусты декоративной и периллы по сравнению с зелеными поглощают больше, но отражают и пропускают меньше лучей зеленой области спектра. В листьях ряда антоциановых растений на долю антоцианов приходилось 12—30 % общей суммы поглощенной радиации (Ishikura, 1978). На основании данных об оптических свойствах листьев, содержащих антоцианы, по ряду свойств последних следует предположить их участие в качестве фоторегуляторного компонента при полифункциональном использовании света растениями. В таком аспекте антоцианы почти не изучались. Видимо, они могут включаться в качестве переносчиков электронов в электронно-транспортной цепи на различных участках, например между первичным акцептором ФСII, дихлорфенолиндофенолом и феррицианидом (модельные системы) (Рузиева и др., 1987). Усиление электронного транспорта по электронно-транспортной цепи фотосинтеза под влиянием антоцианов свидетельствует, по мнению авторов, о том, что антоцианы в зависимости от ситуации могут выполнять роль эндогенных факторов, способствующих более эффективному использованию света при неблагоприятных внешних условиях.
Исследованиями Р.М. Севдималиева и его соавторов (1990) показано, что экзогенные антоцианы, добавленные к хлоропластам гороха, влияют на фотохимические реакции, происходящие в реакционном центре ФСII. Антоцианы влияют на процесс переноса электрона на донорной и акцепторной частях реакционных центров ФСII, а также являются тушителями флуоресценции хлорофилла. Предполагается, что тушение флуоресценции вызвано образованием нефлуоресцирующего
81
Глава 3
комплекса между молекулами антоцианов и хлорофилла в основном состоянии. Отмечается неожиданная способность антоцианов растворяться в тилакоидной мембране хлоропластов
(Sharma, Banerji, 1981).
Показано усиление реакции Хилла антоцианами при освещении светом ламп накаливания и на зеленом свете, которому, как отмечалось выше, принадлежит максимум в спектре действия антоцианов (Dhawale et al., 1983). При указанном освещении антоцианы, добавленные к суспензии хлоропластов
Rosa damascene Mill. и Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch,
усиливали реакцию Хилла с дихлорфенолиндофенолом. Возможен перенос энергии от антоцианов к хлорофиллу. Развитие этих работ привело к подтверждению участия флавоноидов, связанных с хлоропластами, в фотосинтетических реакциях. Об этом говорят и данные о том, что хлоропласты из красной части цветка Amaryllis vittata L'Her. имели в 3 раза более высокую активность (в расчете на хлорофилл) реакции Хилла, чем хлоропласты из зеленой части цветка; при добавлении к последним экстракта антоциана скорость реакции Хилла увеличивалась в 2 раза.
Следовательно, участие флавоноидов в регуляции энергетических процессов не вызывает сомнений, хотя до полной ясности регуляторного механизма еще далеко. Поставленный нами вопрос о возможном участии флавоноидов в интегративном использовании поглощенной световой энергии пока не решен и требует изучения (Масленников, 2003). На пути к развитию фотоинтегративного принципа с участием флавоноидов в его реализации стоит задача изучить последовательность, соподчиненность в функционировании фитохрома и криптохрома, а также условий, при которых это не соблюдается. Если будет доказан перенос энергии от антоцианов к хлорофиллу, то указанный вопрос приобретет важное фотоэнергетическое значение. Все это должно способствовать дальнейшему изучению механизма нефотосинтетического использования энергии
82
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
света как в этиолированных, так и в содержащих хлорофилл клетках. Немалую роль здесь должно сыграть изучение фотоиндуцированных генетических процессов, определяющих фоторегуляцию флавоноидов.
Таким образом, физиологическая роль и механизм индукции биосинтеза антоцианов еще не вполне выяснены, особенно в отношении нерепродуктивных тканей. Обсуждается ряд гипотез, из которых наибольшего внимания заслуживают следующие:
а) трансформация количественных и качественных характеристик поглощенного света (Hughes et al., 2008);
б) защита от ультрафиолетового излучения (Burger, Edwards, 1996);
в) защита от травоядных (Karageorgou, Manetas, 2006);
г) предохранение фотосинтетического аппарата от фото-
ингибирующих процессов (Liakopoulos et al., 2006); д) защита от АФК (Yamasaki et al., 1996).
3.3.Влияние экологических факторов на образование антоцианов
Свет
Известно, что содержание антоцианов у растений разных видов неодинаково и зависит от многих факторов, главный из которых — освещение (Singh et al., 1999; Масленников, Чупахина, 2001а). Внимание большинства исследователей сфокусировано на фотоиндукции биосинтеза антоциановых пигментов УФ- и ДК-светом, при этом механизм взаимодействия высокоэнергетической реакции (ВЭР) и низкоэнергетической реакции (НЭР), проявляющийся в накоплении антоцианов, остается недостаточно ясным. Фотоиндукция биосинтеза антоцианов СС и БС получила гораздо меньшее внимание (Merzlyak, Chivkunova, 2000; Масленников, Чупахина, 2001б). Например,
83
Глава 3
было показано, что дальний красный свет (ДК) и УФ-свет действуют независимо на образование антоцианов в Rumex patientia L. (Lindoo, Caldwell, 1978).
Дальнейшие исследования также не внесли никакой ясности в этот процесс. Изучение световой индукции биосинтеза антоцианов на различных видах растений и тканей разделило исследователей на два лагеря. Первые полагали, что синтез антоцианов активируется УФ-B-рецептором (Brandt et al., 1995). Другие говорили о существовании некоторой комбинации между УФ-B-рецептором, криптохромом и фитохромом (Fambrini et al., 1993). Кроме того, возможно участие в процессе биосинтеза пигментов фоторецептора СС/УФ-А (Singh et al., 1999). Убедительные доказательства
вподдержку первой гипотезы были продемонстрированы K. Брандтом и соавторами (Brandt et al., 1995). Было показано, что мутантные растения (Lycopersicon), имеющие дефицит фитохромного фоторецептора, аккумулировали антоцианы после экспозиций УФ-В. Эксперименты с исключением УФ (Krizek et al., 1998) показывали значительное уменьшение уровня как флавоноидов, так и антоцианов в растениях салата (краснолепестковая форма). Было продемонстрировано (Ambasht, Agrawal, 1995), что накопление антоцианов происходит в растениях кукурузы, выращенных
вполевых условиях, только после облучения соответствующей дозой УФ-света. Противоположный результат был получен на том же объекте в исследованиях Беггса и Веллманна (Beggs, Wellmann, 1985). Эти ученые обнаружили некоторые различия биосинтеза антоцианов в растениях кукурузы в ответ на ДК- и УФ-свет, а также поставили под сомнение наличие фотоиндукционого механизма, запускающего биосинтез данных пигментов.
Видоспецифичность фоторецепторных систем, участвующих в синтезе антоцианов, была исследована и на примере культур клеток и тканей. Показано, что в каллюсных тканях Haplopappus gracilis (Nutt) образование антоцианов индуциру-
84
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
ется лишь синим светом (Запрометов, 1993), а в суспензионной культуре клеток Н. gracilis (Nutt) лишь УФ-светом с длиной волны ниже 345 нм (Запрометов, 1993). В культуре клеток тополя интенсивное образование хризантемина происходило при освещении синим и белым светом.
Имеются данные (Масленников, 2003) об активности синего (480 нм) и дальнего красного (715 нм) света в стимулировании образования антоцианов в зеленых листьях ячменя, кукурузы и горчицы белой. Так, авторами показано увеличение уровня антоциановых пигментов на синем свету в листьях кукурузы на 25,2—26,5 %, на дальнем красном свету — на 31,2—32,9 % (рис. 3.7). В растениях горчицы (1—2-й лист и семядольные листья) уровень антоцианов составил на синем свету 19,3 и 20,5 %; на дальнем красном — 40,1 и 40,8 % от контрольного уровня этих пигментов (рис. 3.8).
% |
160 |
|
|
|
|
|
|
|
140 |
|
|
|
|
|
|
|
|
антоцианов, |
|
|
|
|
|
|
|
|
120 |
|
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
80 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Содержание |
|
|
|
|
|
|
|
|
60 |
|
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
К |
480 |
498 |
545 |
618 |
632 |
715 |
нм |
|
|
|
1-2-й лист |
5-6-й лист |
|
|
||
Рис. 3.7. Влияние монохроматического света на образование антоциановых пигментов в листьях 15-дневных проростковкукурузы (экспозиция — 10 часов)
85
Глава 3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
% |
160 |
|
|
|
|
|
|
|
антоцианов, |
|
|
|
|
|
|
||
140 |
|
|
|
|
|
|
||
120 |
|
|
|
|
|
|
||
100 |
|
|
|
|
|
|
||
80 |
|
|
|
|
|
|
||
Содержание |
60 |
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
||
20 |
|
|
|
|
|
|
||
0 |
|
|
|
|
|
нм |
||
|
|
|
|
|
|
|||
К |
480 |
498 |
545 |
618 |
632 |
715 |
||
|
||||||||
|
Семядольные листья |
Первые настоящие листья |
||||||
Рис. 3.8. Влияние монохроматического света на образование |
||||||||
антоциановых пигментов в листьях 15-дневных проростков горчицы |
||||||||
|
|
(экспозиция — 10 часов) |
|
|
||||
Аналогичное действие СС и ДКС проявилось в проростках ячменя: содержание пигмента при освещении СС составило 23,3 %, а ДКС — 38,3 % от уровня контроля (рис. 3.9). Свет других участков спектра: зеленого (498 нм), зеленого (545 нм), оранжевого (618 нм), красного (632 нм) в растениях горчицы, ячменя и кукурузы не изменял уровень антоцианинов.
|
200 |
|
|
|
|
|
|
|
Содержание антоцианов, % |
150 |
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
50 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
нм |
|
К |
480 |
498 |
545 |
618 |
632 |
715 |
|
|
15-дневные растения |
|
30-дневные растения |
|
||||
Рис. 3.9. Влияние монохроматического света на образование антоциановыхпигментоввлистьях15—30-дневныхпроростковячменя (экспозиция — 10 часов)
86
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
Вто же время биосинтез антоцианов в каллюсной ткани Impatiens balsamina L. был опосредован типичной фитохромной системой с участием красного и дальнего красного света (Запрометов, 1993), в тканях яблока — УФ-В, КС и СС (Arakawa et al., 1985). Также имеются данные, что фитохромная система контролирует активность и синтез ФАЛ, основного фермента биосинтеза флавоноидов (Волынец, Прохорчик, 1983).
Влияние УФ-света на образование антоцианов частично обобщено в работах А. П. Дуброва (1963), согласно которым синтез этих соединений наиболее эффективно протекает в средневолновых УФ-лучах. По мнению Дуброва, он опосредуется через воздействие на генетический аппарат клетки, вызывая тем самым синтез de novo специфических ферментов. Последнее было убедительно продемонстрировано на примере нескольких ферментов биосинтеза фенольных соединений (L-фе- нилаланинаммиак-лиазы, халконсинтазы и халконфлаванонизомеразы) в культуре клеток петрушки, когда удалось установить, что фотоиндукции этих ферментов предшествует индукция активности соответствующих м-РНК. Особое место, как указывает М.Н. Запрометов, в биосинтезе занимает фермент L-фенилаланинаммиаклиаза, так как он находится в точке ответвления биосинтеза фенольных соединений от белка (Запрометов, 1993).
Воснове накопления фенольных соединений в тканях растений под влиянием света лежит активизация ферментов соответствующего биосинтеза. Активность этих ферментов, в том числе ферментов, ответственных за образование антоцианов, регулируется светом. По предложенной Мором гипотезе (Гродзинский, 1972) Ф-730 через сигнальную цепь (медиатор) активирует гены, что и приводит к синтезу соответствующих энзимов. В качестве медиатора может выступать аскорбиновая кислота, которая, по мнению Мора, воздействует на связь ДНК с гистонами: при увеличении концентрации АК некоторые гистоны теряют связь с ДНК, что сопровождается дерепрессией соответствующих генов. Так, в опытах Шопфера ДК-свет
87
Глава 3
усиливал образование аскорбиновой кислоты и антоцианов в проростках горчицы, причем усиление синтеза АК опережало усиление накопления антоцианов и ростовые реакции на ДК-свет. Кроме того, имеются данные о влиянии АК на синтез антоцианов. Если проростки находились на растворе экзогенной АК, синтез антоцианов происходил и в темноте, при этом интенсивность синтеза линейно зависела от концентрации АК. При отсутствии АК синтез в темноте не наблюдался (Гродзин-
ский, 1972).
Различную эффективность действия света разной длины волны на биосинтез антоцианов подтверждают и другие исследования (Волынец, Прохорчик, 1983), установившие наибольшую активность в биосинтезе антоцианов белого света — в отличие от монохроматического любой длины волны. Показано, что белый свет способен индуцировать накопление антоцианов в клетках суспензионной культуры Centaurea cyanus L.
Исследования по продолжительности лаг фазы, после которой начинается быстрое накопление антоцианов, показало постоянную скорость и отсутствие зависимости ее от освещенности и количества света. Например, для гипокотилей гречихи линейная фаза накопления пигментов составляла при 48-часовом фотопериоде 30—35 часов. А с уменьшением продолжительности световой обработки проростков линейная фаза накопления антоцианов сокращалась (Халлоп, Маргна, 1971). Имеются данные, что антоцианы образуются только на свету после более или менее продолжительной лаг-фазы (Волынец, Прохорчик, 1983). Хотя для некоторых растений, в том числе растений кукурузы, отмечается не всегда облигатный светозависимый характер биосинтеза данных пигментов (Singh et al., 1999). Указывается возможность синтеза антоцианов в темноте и при поранении, что свидетельствует о возможности протекания этих процессов без участия ФХ или других фоторецепторов (Волынец, Прохорчик, 1983; Запрометов, 1993). Очевидно, в этих случаях активацию ферментов можно рассматривать как проявление генной регуляции или как результат пе-
88
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
рехода ферментов в растворимое состояние вследствие нарушения структуры клеток.
Положительное действие света на накопление антоцианов сохраняется некоторое время и в темноте. Как и следовало ожидать, продолжительность темнового периода образования фенольных соединений зависела от длины фотопериода или времени непрерывного предосвещения. Так, при выдерживании проростков горчицы белой в темноте после 8—16-часово- го воздействия светом биосинтез антоцианов продолжался, хотя и с менее выраженной интенсивностью, чем на свету. Однако при увеличении периода свыше 24 часов отмечалось заметное разрушение пигментов в темноте. По данным Л.Е. Халлопа и У. В. Маргна (1971), продолжительность темнового периода синтеза антоцианов в гипокотилях гречихи постепенно снижалась, и через 30—32 часа дальнейшее накопление пигментов прекращалось. При использовании искусственного экранирования проростков гречихи наблюдалось 10—20-кратное ослабление образование антоцианов (Халлоп, Маргна, 1971). Влияние семенной оболочки как естественного экрана на накопление антоцианов в проростках гречихи аналогично по характеру, но меньше по величине: содержание антоцианов при удалении оболочки увеличивалось в 2 раза.
Таким образом, можно считать вполне доказанным светозависимый характер биосинтеза антоциановых пигментов, особенно выраженный при наличии в клетках ФХ. Хотя существует ряд исключений, подтверждающих обратное (Garry, Christopher, 1981). Это доказывается дозовой и спектральной характеристиками биосинтеза, а также предварительным (до проявления действия ФХ) освещением проростков СС или УФС. Накапливается все больше данных о вероятности взаимодействия ФХ и рецепторов СС в биосинтезе антоцианов и других флавоноидов, но механизм такого взаимодействия не изучен и нуждается в дальнейших исследованиях.
Так, повышение содержания антоцианов на СС в растениях ячменя, кукурузы и горчицы белой (Масленников, Чупа-
89
Глава 3
хина, 2001б) можно связать с активностью криптохромового фоторецептора, представляющего собой группу фоточувствительных веществ, производных флавинов и каротиноидов, один из максимумов спектра действия которых находится в области СС (400—490 нм) (Mancinelli, 1985). Можно предпо-
ложить также участие в фотоконтроле биосинтеза антоцианов в этих растениях ВЭР или УФ-А/СС-фоторецептора (Singh et al., 1999). Активность ДК-света в биосинтезе антоцианов в проростках кукурузы, горчицы и ячменя может быть обусловлена типичной фитихромной системой. Из двух активных для биосинтеза участков спектра (СС и ДКС) наибольшее влияние в этих растениях оказал ДК свет. Вероятно, это может быть объяснено тем, что для инициирования реакций в синей области спектра необходимы гораздо большие дозы действующего света (ВЭР), чем в дальней красной области (Запрометов, 1993).
С другой стороны, возможно существование двух отдельных путей биосинтеза антоцианинов с различной ферментной и внешней регуляцией (Chalker-Scott, 1999). Например, УФили СС-фоторецептор может выполнять функцию единственного фотоиндуктора, запускающего накопление антоцианов, в то время как их относительное содержание в растительных тканях может регулироваться фитохромом (Chalker-Scott, 1999). Кроме того, различные фотоиндукционые механизмы могут быть обусловлены возможной модификацией вследствие различных этапов развития и действия факторов окружающей среды, таких, например, как температура (Shichijo et al., 1993).
Минеральное питание
Следует отметить, что факт накопления антоцианов вследствие нарушения нормальных условий минерального питания известен уже давно. Так, появление коричневых, бронзовых, красных и пурпурных пятен на листьях растений картофеля, капусты, хлопчатника, томатов в условиях дефицита ряда элементов питания обусловлено присутствием антоцианов. Несмотря на наличие подобных данных, роль антоциановых
90