Природные антиоксиданты (экологический аспект). Монография

Свободные радикалы и окислительный стресс

Лактоновое кольцо в молекуле АК стабильно, а в ДАК легко гидролизует с образованием 2,3-дикетогулоновой кислоты. Реакция необратима и 2,3-дикетогулоновая кислота может подвергаться окислительному распаду с образованием щавелевой и треоновой кислот.

В клетках растений большая часть АК находится в хлоропластах, обнаружена она в митохондриях, около ядер, во внешнем слое цитоплазмы, в вакуолях, пероксисомах, апопласте. Однако нужно иметь в виду, что субклеточная локализация АК в большой степени определяется физиологическим состоянием клетки и ее структур (Чупахина, 1997). Свет стимулирует биосинтез АК. Из донорных листьев АК по флоэме может транспортироваться в акцепторные органы — развивающиеся листья, цветочные почки, плоды, корни.

АК — полифункциональное соединение, но главная ее роль — участие в системах антиоксидантной защиты, действующих в хлоропластах, митохондриях, пероксисомах, цитозоле, апопласте.

АК способна напрямую реагировать с супероксидным и гидроксильным радикалами. Однако основная функция АК в ПОЛ состоит в регенерации токофероксильного радикала:

ТО• + АК → ТОН + А•,

где А• — радикал монодегидроаскорбиновой кислоты. Дальнейшее окисление А• приводит к образованию де-

гидроаскорбиновой кислоты. Окисленные формы АК восстанавливаются ферментами монодегидроаскорбатредуктазой и дегидроаскорбатредуктазой.

Глютатион — основной восстановитель клетки. Как и АК, он восстанавливает токофероксильные радикалы и Н2О2, обезвреживает вторичные метаболиты окислительного обмена. Глютатион-зависимые ферменты работают во всех частях клетки. Антиоксидантный эффект селена также опосредован глютатионпероксидазами.

К важнейшим антиоксидантам клетки относится α-токо- ферол (витамин Е). Кроме него известны токоферолы β, γ и δ, которые различаются по количеству и положению метильных групп в ароматическом кольце. Все токоферолы являются ли-

11

Глава 1

пидорастворимыми амфипатическими соединениями. Гидрофобная часть их молекул связана с липидами, а гидрофильная направлена к поверхности мембран.

Токоферолы синтезируются только фототрофами, животные и человек получают их с растительной пищей. В фотосинтезирующих тканях доминирует α-токоферол, в нефотосинте-

зирующих — γ-токоферол (Munne-Boch, Falk, 2004). Состав и содержание токоферолов в тканях растений могут сильно варьировать.

Токоферолы поддерживают стабильность мембран хлоропластов и митохондрий; α-токоферол мембран защищает их от действия АФК, вызывает обрыв цепей свободнорадикального окисления. Он нейтрализует свободные радикалы мембранных липидов, отдавая свой электрон и восстанавливая липидные радикалы, и в результате сам становится радикалом, но быстро получает потерянный электрон, восстанавливаясь АК. При этом АК окисляется до монодегидроаскорбиновой кислоты, которая может быть восстановлена НАДН или НАДФН при участии монодегидроаскорбатредуктазы.

Токоферол взаимодействует с супероксидным анион-ра- дикалом и синглетным кислородом. Кроме того, он снижает проницаемость мембран, связывает свободные жирные кислоты, избыток которых дестабилизирует мембранную структуру.

Витамин Е — один из самых сильных природных антиоксидантов, прежде всего липидов.

Антиоксидантными свойствами обладают биофлавоноиды — вещества фенольной природы, синтез которых активируется в стрессовых условиях (Костюк, Потапович, 2004). Они могут быть донорами атома водорода из ОН-группы ароматического кольца, что способствует ликвидации свободных радикалов, окисляющих липиды и другие важные биомолекулы (Takahama, Oniki, 2000). Полифенолы также могут связывать металлы переменной валентности, которые выступают катализаторами свободнорадикального окисления (Чиркова, 2002).

В обзоре (Takahama, Oniki, 2000) указывается, что антиоксидантным действием обладают восстановленные формы

12

Свободные радикалы и окислительный стресс

биологически активных хинонов — убихинона (коэнзима Q), филлохинона (витамин К1), менахинона (витамин К2), менадиона (витамин К3), хотя они не имеют «подвижного» атома водорода, благодаря которому могли бы легко вступать во взаимодействие со свободными радикалами. Однако экспериментальные данные показывают, что эндогенный убихинон и витамины группы К являются эффективными потенциальными антиоксидантами и способны предохранять биологические мембраны от повреждающего действия свободнорадикальных процессов.

К липофильным антиоксидантам относятся каротиноиды, которые участвуют в тушении избыточной энергии триплетных хлорофиллов и синглетного кислорода. Воспринимая энергию возбуждения, они рассеивают ее в виде тепла, тем самым предотвращая возможность образования синглетного кислорода. В тканях листьев при осеннем старении и в плодах при созревании сохраняется много каротиноидов, способных дезактивировать АФК, особенно синглетный кислород.

Каротиноиды могут взаимодействовать с органическими радикалами жирных кислот. В этом случае они действуют не как доноры водорода, а как «ловушки» радикалов (Чиркова, 2002).

Антиоксидантные свойства характерны для изопрена (С5Н8, 2-метил-1,3-бутадиен), относящегося к терпенам. Он синтезируется в хлоропластах только на свету и не запасается в тканях листа, а сразу улетучивается в атмосферу. При высоких температурах в клетках листа усиливается синтез изопрена, возрастает и уровень АФК, появляются некрозы. Изопрен снижает уровень АФК и препятствует повреждению мембран, хотя механизм этого процесса неизвестен (Полесская, 2007).

Основную роль в снижении уровня АФК играют ферменты антиокислительной системы: супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, глютатион-трансфераза, фосфолипидгидропероксидаза, глютатионпероксидаза, глютатионредуктаза, а также ферменты аскорбат-глютатионового цикла: аскорбатпероксидаза, монодегидроаскорбатредуктаза, дегидроаскорбатредуктаза (Чиркова, 2002; Попов и др., 2006; Дерябин

13

Глава 1

и др., 2007; Polle, 2001; Arora et al., 2002; Mittler, 2002; Harrach et al., 2005).

Устойчивые растения обладают более высоким содержанием аскорбата, α-токоферола, активностью антиоксидантных ферментов.

Ответ антиоксидантной системы на один и тот же стрессор зависит от вида растений, степени и продолжительности стрессового воздействия, от характера стрессового фактора, состояния антиоксидантной системы, исходного уровня антиоксидантной активности, возраста растений и условий их выращивания. Поэтому оценка успешности антиоксидантной защиты предполагает всестороннее исследование данного многофакторного процесса.

Библиографический список

1.Дерябин А. Н., Синькевич М. С., Дубинина И. М. и др. Влияние сахаров на развитие окислительного стресса, вызванного гипотермией (на примере растений картофеля, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей) // Физиология растений. 2007. Т. 54, №1. С. 39—46.

2.Костюк В. А., Потапович А. И. Биорадикалы и биоантиоксиданты. Минск: Изд-во БГУ, 2004.

3.Полесская О. Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. М.: Изд-во КДУ, 2007.

4.Попов В. Н., Кипайкина Н. В., Астахова Н. В., Трунова Т. И.

Особенности окислительного стресса растений табака, трансформи-

рованных геном desC 9-ацил-липидной десатуразы из Synechococcus vulcanus, при гипотермии // Физиология растений. 2006. Т. 53,

№4. С. 525—529.

5.Чиркова Т. В. Физиологические основы устойчивости растений. СПб.: Изд-во СПбГУ, 2002.

6.Чупахина Г. Н. Система аскорбиновой кислоты растений: монография / Калинингр. ун-т. Калининград, 1997.

7.Arora A., Sairam R. K., Srivastata G. S. Oxidative stress and antioxidative system in plants // Current Science. 2002. Vol. 82. Р. 1227—1238.

8.Harrach B. D., Fodor J., Barna B. Changes of antioxidants following powdery mildew infection of near-isogenic barley lines carrying different resistance genes // Proceedings of the 8th Hungarian Congress

14

Свободные радикалы и окислительный стресс

on Plant Physiology and the 6th Hungarian Conference on Photosynthesis. Budapest, 2005. Р. 91—92.

9.Mittler R. Oxidative stress. antioxidants and stress tolerance // Trends Plant Sci. 2002. Vol. 7. Р. 405—410.

10.Munne-Boch S., Falk J. New insights into the function of tocopherols in plants // Planta. 2004. Vol. 218. P. 323—326.

11.Polle A. Dissecting the Superoxide Dismutase-Ascorbate-Gluta- thione-Pathway in Chloroplasts by Metabolic Modeling. Computer Simulations as a Step towards Flux Analysis // Plant Physiol. 2001. Vol. 126. Р. 445—462.

12.Takahama U., Oniki T. Flavonoides and some other phenolics as substrates of peroxidase: physiological significance of the redox reactions // Plant Res. 2000. Vol. 133. P. 301—309.

15

Глава 2

Глава 2

ФЕРМЕНТАТИВНАЯАНТИОКСИДАНТНАЯСИСТЕМАРАСТЕНИЙ

К антиоксидантным ферментам относят супероксиддисмутазу, каталазу, глютатионпероксидазу, глютатион-S-транс- феразу, глютатионредуктазу, а также ферменты аскорбат-глю- татионового цикла — аскорбатпероксидазу, монодегидроаскорбатредуктазу и дегидроаскорбатредуктазу (Asada, 1994; Foyer et al., 1994; Polle, 2001; Arora et al., 2002; Mittler, 2002).

Как правило, в детоксикации АФК участвует несколько сопряженных ферментативных систем и низкомолекулярных антиоксидантов.

Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенных форм АФК, специфичностью клеточной и органной локализации, спецификой использования металлов в качестве катализаторов, к которым относят медь, цинк, марганец, железо, никель, а также неметалл селен.

Кроме того, в отличие от неферментативных антиоксидантов для антиоксидантных ферментов характерно значительное время, необходимое для индукции их синтеза, и быстрая инактивация конституционного пула ферментов свободными радикалами (Кения и др., 1993).

2.1. Супероксиддисмутаза

Супероксиддисмутаза — СОД (КФ 1.15.1.1) впервые была выделена из крови вола и описана как сине-зеленый белок, связывающий ионы меди. Антиоксидантные свойства супероксиддизмутазы были открыты позже, в 1967 г., Мак-Кордом

16

Ферментативная антиоксидантная система растений

и Фридовичем (Giannopolitis, Ries, 1977; Bowler et al., 1992; Scandalios, 1993). Установлено, что СОД катализирует реак-

ции дисмутации О•2− в хлоропластах, митохондриях и цитозоле:

2 О•2− + 2Н+ → Н2О2 + О2.

Супероксидный радикал в водных растворах может дисмутировать и неферментативным путем, однако супероксиддисмутаза значительно ускоряет эту реакцию. Так, скорость спонтанной реакции при нейтральных рН не превышает 7 • 105 М/с, в присутствии же СОД скорость реакции возрастает до 2 • 109 М/с, т. е. приблизительно в 104 раз (Ogawa et al., 1996).

Всвязи с тем, что супероксиддисмутаза присутствует во всех аэробных организмах и большинстве субклеточных компонентах, производящих АФК, был сделан вывод, что именно СОД принадлежит важная роль в защите против окислитель-

ного стресса (Bowler et al., 1992; Scandalias, 1993).

Врастениях присутствует несколько форм СОД, содержащих в активных центрах медь и цинк (CuZnСОД), железо (FeСОД) или марганец (MnСОД). Изоформы СОД могут быть разделены электрофорезом и идентифицированы на основании их чувствительности к цианиду и перекиси водорода. MnСОД устойчива к обоим ингибиторам, тогда как CuZnСОД реагирует как на пероксид водорода, так и на цианид, FeСОД устой-

чива к цианиду и чувствительна к H2O2 (Романова, 2008). Поверхность супероксиддисмутазы несет отрицательный

заряд, однако в строении молекулы выявлены положительно заряженные каналы, которые ведут к активным центрам и служат, как предполагается, для захвата отрицательно заряженных частиц супероксид анион-радикалов. В результате та-

кого избирательного захвата ионов О•2− значительно повыша-

ется скорость реакции дисмутации (Бараненко, 2006). MnСОД и FeСОД найдены во всех прокариотах, в отли-

чие от CuZnСОД, которая для них не характерна, зато присутствует в клетках большинства эукариотов (Романова, 2008).

17

Глава 2

MnСОД и FeСОД, содержащиеся в клетках прокариот, и эукариотическая CuZnСОД являются димерами, тогда как MnСОД, локализованная в митохондриях эукариот, — тетра-

мер (Scandaliоs, 1993).

Сравнение данных о локализации разных форм СОД показывает, что наиболее изобильна в клетках растений CuZnСОД. Она обнаружена во всех внутриклеточных компартментах — в цитозоле, митохондриях, пероксисомах, a также в апопласте (табл. 2.1). Что касается MnСОД и FeСОД, они обнаружены лишь в определенных органеллах. В частности, MnСОД расположена в митохондриях и пероксисомах, а FeСОД — в хлоропластах и цитоплазме клубеньков некоторых бобовых (Бара-

ненко, 2006).

Таблица 2.1

Характеристика и локализация изоформ СОД в клетках растений

18

Ферментативная антиоксидантная система растений

Цитозольная форма CuZnСОД обнаружена возле или на тонопласте, а также в самом ядре, что указывает на образование супероксидных радикалов внутри ядра (Ogawa et al., 1996). В ядре СОД (до 80 %) связана с ДНК-филаментами, защищая их от окислительных повреждений (Ogawa et al., 1996). Данная изоформа обнаружена также возле или на цитоплазматической мембране (Ogawa et al., 1996). В хлоропластах CuZnСОД локализована в мембранах тилакоидов и стро-

ме (Ogawa et al., 1995; Gomez et al., 2004). В частности, около

70 % CuZnСОД прикреплено к стромальной поверхности мембран тилакоидов, где расположен комплекс фотосистемы I (Ogawa et al., 1995). Отмечено, что локальная концентрация фермента в мембранах тилакоидов составляет около 1 мМ, тогда как в строме — около 20 мкМ (Ogawa et al., 1995). Таким образом, большее количество СОД прикреплено к тилакоидным мембранам, и это свидетельствует о том, что в них продукция супероксидных радикалов выше по сравнению со стромой.

Фермент обнаружен также во внутритилакоидном пространстве хлоропластов (около 4 % хлоропластной CuZnСОД) (Науаkawa et al., 1984). Посколькуосновноеколичество CuZnСОД в клетках листьев растений, как свидетельствуют данные литературы, локализовано в хлоропластах (Asada, 1999), очевидно, что последние являются важным источником супероксидных радикалов в клетке. Кроме хлоропластов CuZnСОД обна-

ружена в матриксе пероксисом (Sandalio, Del Rio, 1987; Corpas et al., 1998), где она является также преобладающей изоформой СОД. На долю пероксисомной CuZnСОД приходится около 18 % общей активности СОД в клетках растений (Sandalio, Del Rio, 1987). В апопласте данная изоформа принимает участие в лигнификации клеточных стенок и защите клеток и тканей растений от патогенов (Ogawa et al., 1997).

MnСОД обнаружена в матриксе митохондрий и пероксисом (Del Rio et al., 2003). FeСОД в клетках растений располо-

19

Глава 2

жена главным образом в хлоропластах — как в строме, так и на мембранах тилакоидов (Gomez et al., 2004). Кроме хлоропластов обнаружена локализация фермента в нефотосинтезирующих органеллах и тканях: в пероксисомах листьев Lycopersicon esculentum (Mittova et al., 2003), пероксисомах лепест-

ков гвоздики (Droillard, Paulin, 1990), а также в цитозоле клубеньков некоторых бобовых — клевера, сои и фасоли (Moran et al, 2003). Однако не у всех бобовых найден фермент в цитозоле клубеньков: у люцерны и гороха он локализован исключительно в хлоропластах (Moran et al., 2003).

Достаточно важен вопрос регуляции СОД. Литературные данные свидетельствуют о том, что регуляция активности фермента происходит на разных уровнях: на уровне транскрипции, трансляции и (или) путем посттрансляционной модификации молекул СОД (Бараненко, 2006).

Влияние экологических факторов на активность супероксиддисмутазы

Свет

Показано, что выращивание растений бегонии при низкой интенсивности света (I = 25 мкмоль м–2 • с–1) ведет к снижению активности фермента более чем в 2 раза по сравнению с растениями, выращенными при более высокой интенсивности света (I = 155 мкмоль м–2 • с–1) (Burritt, Mackenzie, 2003). Пря-

мая корреляционная зависимость между активностью супероксиддисмутазы и интенсивностью света была выявлена и в работе (Cakmak, Marschner, 1992).

Вместе с тем в ряде исследований показана инвариантность активности супероксиддисмутазы при изменении интенсивности света. Например, изучалось действие света повышенной интенсивности (I = 360 мкмоль м–2 • с–1) на активность антиоксидантных ферментов в растениях табака. Было уста-

20