Природные антиоксиданты (экологический аспект). Монография

Ферментативная антиоксидантная система растений

1994). Вместе с тем дегидроаскорбатредуктаза была обнаружена как в растительных, так и в животных клетках (Wells et al., 1990; Xu et al., 1996; Dipierro, Borraccino, 1991; Foyer, Mullineaux, 1998; Hou et al., 2000; Foyer, Noctor, 2005). Антиокси-

дантная роль дегидроаскобатредуктазы определяется, прежде всего, ее участием в регерации аскорбиновой кислоты. (Chen, Gallie, 2006).

Монодегидроаскорбатредуктаза — МДГАР (КФ 1.6.5.4) — фермент, участвующий в восстановлении монодегидроаскорбата до аскорбиновой кислоты:

2МДАК + НАДН + Н+ → 2АК + НАД+.

Врастениях МДГАР локализована в различных частях клетки — хлоропластах, цитозоле, митохондриях, пероксисомах.

Кроме участия в поддержании постоянного уровня восстановленной аскорбиновой кислоты монодегидроаскорбатредуктаза выступает посредником в реакции фотовосстановления супероксидного анион-радикала в хлоропластах клетки

(Miyake et al., 1998).

Влияние экологических факторов на активность ферментов аскорбат-глютатионового цикла

Свет

Реакция ферментов аскорбат-глютатионового цикла на стресс, вызванный светом высокой интенсивности, может быть различной и зависит от продолжительности действия стрессового фактора и вида растения.

Изучение влияния света высокой интенсивности (I = = 360 мкмоль м–2 • с–1) на активность антиоксидантных ферментов в растениях табака показало, что уже через 24 часа после начала действия стрессового фактора активность аскорбатпероксидазы резко повышалась (почти на 20 %). На 4-й день эксперимента активность АПО была максимальной, превышая контрольные значения более чем в 2 раза. Активность дегидроаскорбатредуктазы и монодегидроаскорбатредуктазы не ме-

нялась (Gechev et al., 2003).

41

Глава 2

Вработе по изучению роли антиоксидантов при акклиматизации растений бегонии к высокоинтенсивному свету также было установлено повышение активности АПО уже через 24 часа после начала световой экспозиции. При этом активность ДГАР и МДГАР также увеличивалась, хотя и не столь резко

(Burritt, Mackenzie, 2003).

Выявлена активация аскорбатпероксидазы при облучении растений УФ-В светом(Kubo et al., 1999; Махдавиани др., 2008).

Внашей работе, посвященной изучению влияния света высокой интенсивности (I = 520 мкмоль м–2 • с–1) на антиоксидантную систему растений ячменя, было установлено повышение активности аскорбатпероксидазы и дегидроаскорбатредуктазы в растениях после 12-часовой световой экспозиции на 10 и 16 % соответственно (Скрыпник, Чупахина, 2007).

Однако изучение действия света высокой интенсивности на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных в условиях дефицита цинка, показало снижение активности фермента после 12-часовой световой экспозиции (рис. 2.11) (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008).

Рис. 2.11. Влияние интенсивности света на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя и капусты китайской,

выращенных при дефиците цинка:

для ячменя: I1 = 160 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 520 мкмоль м–2 • с–1; длякапустыкитайской: I1 = 290 мкмольм–2 • с–1, I2 = 680 мкмольм–2 • с–1

42

Ферментативная антиоксидантная система растений

Как видно из представленных данных, активность каталазы в листьях ячменя уменьшилась на 12 %, а в листьях капусты китайской менее чем на 10 % после облучения растений светом высокой интенсивности.

Температура

Показана важная роль аскорбатпероксидазы в нейтрализации пероксида водорода, активно образующегося в клетках в первые часы холодового повреждения растений. Близкая к нулю температура (2 °С) оказывала значительное влияние на активность АПО в листьях ячменя, максимальное значение которой наблюдали уже через 8 часов действия стрессового фактора. Затем активность АПО снижалась и в постстрессовый период не отличалась от значений, зарегистрированных в контрольных растениях (Радюк и др., 2009).

Исследовалось действие низких положительных температур (2 °С, 24 часа) на активность антиоксидантных ферментов растений с различной степенью холодоустойчивости. Автором было установлено незначительное изменение активности АПО у различных видов растений при выдерживании их при температуре 2 °С (Лукаткин, 2002).

Было выявлено снижение активности АПО, ДГАР и МДГАР при действии на растения табака низких положительных темпе-

ратур (5 °С, 4 дня) на 45, 62 и 43% соответственно (Gechev et al., 2003). Однако имеются данные о повышении активности аскорбатпероксидазы в листьях Arabidopsis thaliana (L.) при действии на растения низких положительных температур (5 °С) и отсутствии достоверного изменения активности ДГАР и МДГАР в растениях при данныхусловиях (Kubo et al., 1999).

Минеральное питание

Ферменты аскорбат-глютатионового цикла по-разному реагируют на нарушение минерального питания растений.

Выявлено увеличение активности АПО и МДГАР на 80 и 90 % соответственно при недостаточном обеспечении расте-

43

Глава 2

ний ели обыкновенной марганцем. Достоверного же изменения в активности ДГАР в данном эксперименте установлено не было (Polle et al., 1992).

Кроме того, установлено значительное увеличение активности аскорбатпероксидазы и дегидроаскорбатредуктазы в листьях фасоли, выращенной при дефиците магния. Уровень активности АПО в Mg-дефицитных растениях был более чем в 7 раз, а ДГАР-дефицитных более чем в 3 раза выше, чем в кон-

трольных растениях (Cakmak, Marschner, 1992).

В нашей работе проводилось изучение влияния селена и цинка на активность аскорбатпероксидазы и дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). Как показали результаты исследования, при исключении из питательной среды цинка активность АПО снизилась на 25 % (рис. 2.12). Добавление в питательную среду селена способствовало повышению активности АПО. Однако данный эффект наблюдался только при цинковом дефиците, так как добавление селена в Zn-содержащую питательную среду приводило к уменьшению активности аскорбатпероксидазы в исследуемых растениях.

Рис. 2.12. Влияние селена и цинка на активность аскорбатпероксидазы в листьях ячменя

44

Ферментативная антиоксидантная система растений

Активность дегидроаскорбатредуктазы также снижалась при исключении из питательной среды цинка (рис. 2.13). Добавление же селена положительно сказывалось на функционировании данного фермента, увеличивая его активность до исходного уровня.

Рис. 2.13. Влияние селена и цинка на активность дегидроаскорбатредуктазы в листьях ячменя

Кроме того, проводилось исследование влияния селена и цинка на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя и китайской капусты, подвергнутых действию света высокой интенсивности (рис. 2.14—2.15) (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008). В ходе исследования было установлено положительное влияние микроэлемента селена на активность дегидроаскорбатредуктазы как в растениях капусты китайской, так и в растениях ячменя.

45

Глава 2

Рис. 2.14. Влияние селена и цинка на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях капусты ки-

тайской на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 680 мкмоль м–2 • с–1)

Рис. 2.15. Влияние селена и цинка на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя

на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 520 мкмоль м–2 • с–1)

46

Ферментативная антиоксидантная система растений

Действие тяжелых металлов

Выявлено снижение активности АПО и ДГАР в листьях тыквы обыкновенной, выращенной на питательной среде, содержащей 10 мМ меди. Активность АПО уменьшилась в 3 раза, ДГАР — более чем в 2 раза по сравнению с контрольным вариантом (El-Shora, 2003). Уменьшение активности аскорбатпероксидазыпривоздействиинарастениятяжелыхметалловнаблюдалитакже в работе, посвященной изучению влияния никеля (0,25 мМ) на антиоксидантнуюсистемурастенийсои(Саиди-Саиридр., 2007).

Исследовано влияние различных концентраций цинка (1—1000 мкмоль/л) на систему антиоксидантной защиты в корнях Sedum alfredii двух экотипов: гипераккумуляторов цинка (ГА) и не аккумулирующих цинк растений (НА). Активности АПО в корнях НА заметно повышались при более низких концентрациях (максимум при 250 мкМ), а при дальнейшем повышении концентрации Zn снижалась. В то же время в корнях ГА значительное повышение активности АПО наблюдали даже при 1000 мкМ (активность превышала контроль в 2,1 раза). Тот факт, что высокая активность аскорбатпероксидазы в ГА коррелирует с большей биомассой и высокими концентрациями Zn в растениях, предполагает роль этого фермента в поддержании роста растений при загрязнении почвы тяжелыми металлами (Ли и др., 2008).

Солевой стресс

Имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют о важной роли ферментов аскорбат-глютатионового цикла при адаптации растений к солевому стрессу.

Так, в работе Ф. Ясар и соавторов наблюдали значительное повышение активности аскорбатпероксидазы в растениях фасоли — как солеустойчивого сорта, так чувствительного к засолению. Однако скорость повышения активности АПО была выше в растениях, устойчивых к засолению (Ясар и др., 2008). Вероятно, повышение активности аскорбатпероксидазы при адаптации растений к солевому стрессу и обеспечивает их устойчивость к засолению.

47

Глава 2

Было установлено (Полесская и др., 2006), что изменение активности аскорбатпероксидазы в листьях и корнях растений пшеницы при солевом стрессе зависело и от азотного питания растений. Так, активность АПО значительно возрастала в ли-

стьях NH+4 -растений, падала у NO3− -растений и достоверно не

изменялась у N-дефицитных растений. В корнях исследуемых растений наблюдали уменьшение активности аскорбатперок-

сидазы, особенно у NO3− -растений. У листьев NO3− -растений

при засолении признаки окислительного стресса были выражены намного сильнее, что коррелировало со снижением ак-

тивности АПО. Устойчивость же NH+4 -растений к солевому

стрессу, возможно, связана именно с быстрой мобилизацией и активацией аскорбатпероксидазы.

2.5. Глютатионредуктаза

Глютатионредуктаза — ГР (КФ 1.6.4.2) — важный фермент системы антиоксидантной защиты растений. Она катализирует восстановление дисульфидной связи окисленного глютатиона GSSG до его сульфгидрильной формы GSH. Восстановление глютатиона происходит за счет энергии НАДФ-Н, образующегося в пентозном цикле:

GSSG + НАДФН + Н+ → 2GSH + НАДФ+.

В растениях имеется четыре изоформы глютатионредуктазы, которые ассоциированы с разными клеточными компартментами. Наибольшее количество этого фермента находится в хлоропластах, выявлены изоэнзимы ГР в цитозоле и мито-

хондриях (Romero-Puertas et al., 2006).

Влияние экологических факторов на активность глютатионредуктазы

Свет

В работе, посвященной изучению адаптационных механизмов растений к высокоинтенсивному свету, было показано, что активность глютатионредуктазы увеличивается при экспо-

48

Ферментативная антиоксидантная система растений

зиции растений бегонии на свету повышенной интенсивности

(I = 155 мкмоль м–2 • с–1) (Burritt, Mackenzie, 2003).

Однако большее число работ свидетельствует об инвариантности активности глютатионредуктазы в растениях, подвергнутых действию света высокой интенсивности. Так, не выявлено достоверного изменения активности глютатионредуктазы в растениях фасоли, на которые воздействовали светом высокой интенсивности (580 мкмоль м–2 • с–1) (Cakmak, Marschner, 1992). Аналогичный результат получен и в работе по изучению действия света высокой интенсивности (I = = 360 мкмоль м–2 • с–1) на активность антиоксидантных ферментов в растениях табака (Gechev et al., 2003).

Не выявлено достоверного изменения активности ГР в листьях растений Arabidopsis thaliana (L.) при увеличении интенсивности света до 200 мкмоль м–2 • с–1. Однако некоторыми исследователями было зафиксировано резкое повышение активности фермента при действии на растения УФ-излучения

(Kubo et al., 1999).

Температура

Изучалось действие низких положительных температур на активность антиоксидантных ферментов в листьях ячменя. Близкая к нулю температура (2 °С) оказывала значительное влияние на активность ГР. Активность ГР быстро возрастала в первые 8 часов действия стресса, после чего следовало более медленное увеличение ее активности, которая к концу стрессового периода на 60 % превышала первоначальное значение. После снятия стресса активность ГР снижалась до исходного уровня (Радюк и др., 2009). Сходный результат получен и в работе (Kubo et al., 1999), где было показано увеличение активности ГР в листьях растений Arabidopsis thaliana (L.) при воздействии на них низких положительных температур (5 °С, 7 дней).

Однако имеются данные о снижении активности глютатионредуктазы в листьях табака при действии на растения низких положительных температур (5 °С, 4 дня) (Gechev et al., 2003).

49

Глава 2

Минеральное питание

На сегодняшний день имеются противоречивые данные о роли глютатиоредуктазы при стрессе, вызванном дефицитом макро- и микроэлементов. Например, было выявлено значительное увеличение активности глютатионредуктазы в листьях фасоли, выращенной при дефиците магния. Активность ГР повышалась более чем в 3 раза по сравнению с контрольными значениями (Cakmak, Marschner, 1992). Вместе с тем достоверного изменения активности ГР в хвое ели обыкновенной при дефиците марганца выявлено не было (Polle et al., 1999).

Действие тяжелых металлов

Изучение влияния меди на антиоксидантный статус листьев растений тыквы обыкновенной, выращенной на питательной среде, содержащей 10 мМ меди, показало снижение активности глютатионредуктазы более чем в 1,5 раза под действием меди по сравнению с контрольным вариантом (El-Shora, 2003).

Солевой стресс

Изучено влияния азотного питания на развитие окислительного стресса и изменение антиоксидантного статуса в растениях пшеницы, выращенной в условиях сильного засоления. Выявлено увеличение активности глютатионредуктазы в листьях пшеницы независимо от азотного питания. В корнях же исследуемых растений наблюдали уменьшение активности

фермента в N-дефицитных растениях и увеличение в NH+4 -рас- тениях. В NO3− -растениях достоверного изменения активности

ГР в корнях растений при солевом стрессе выявлено не было (Полесская и др., 2006).

Исследовано действие высоких концентраций хлорида натрия (100 мМ) на антиоксидантный статус двух сортов топинамбура, отличающихся устойчивостью к засолению. Авторами было выявлено повышение активности глютатионредук-

50