Природные антиоксиданты (экологический аспект). Монография
.pdf
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
Наиболее общепринятая классификация флавоноидов предусматривает их деление на 11 основных классов исходя из степени окисленности или восстановленности трехуглеродного фрагмента: катехины (флаван-3-олы), лейкоантоцианидины (флаван-3,4-диолы), флаваноны, дигидрохалконы, халконы, антоцианидины, дигидрофлаванолы, флавоны, флавононы, ауроны и флаваны. Катехины, лейкоантоцианидины, дигидрохалконы, флаваноны и дигидрофлаванолы не имеют окраски, все же другие классы флавоноидов представляют собой окрашенные соединения.
Термин «антоцианы» (от греч. антос — цветок; кианос — синий) охватывает как флавилевые агликоны, так и их гликозиды. В англоязычной литературе для гликозидов антоцианидинов используется термин «антоцианины», но в русской литературе он не нашел распространения. Наряду с хлорофиллом и каротиноидами антоцианы выступают главными красящими веществами растений. Они придают плодам, ягодам, листьям и цветкам окраску самых разнообразных оттенков: от розового до черно-фиолетового (Brouillard, 1993). Эти пигменты вносят свой вклад как в быстро изменяющуюся окраску молодых листьев, так и в появление у них осенних тонов, при этом почти во всех случаях отмечается участие цианидин-3-глюкозида.
Помимо шести основных антоцианидинов (пеларгонидин, цианидин, пеонидин, дельфинидин, петунидин, мальвидин), имеющих 5,7-диокси-замещение в кольце А, существуют и другие агликоны антоцианидиновой природы. Например, аурантинидин, содержащийся в цветках недотроги (Impatiens aurantiaka Teijsm. ex Koord.), розинидин из цветков примулы
(Primula rosea Royle) и хирзутидин из Gatharanthus roseus (L.) G. Don (Запрометов, 1993).
Известны также три агликона без гидроксилирования в пирановом гетероцикле (3-дезоксиантоцианидины). Они содержатся главным образом во мхах и папоротниках, за редким исключением — у цветковых растений. Многочисленность антоцианов объясняется не только большим числом агликонов, но и огромным разнообразием гликозидных форм. Так, для пеларгонидина известно более 40 гликозидов (Timberlake, 1980).
61
Глава 3
По Дж. Харборну, антоцианы подразделены на 21 подгруппу в зависимости от места присоединения и природы сахарного остатка. Среди монозидов антоцианов наиболее часто встречаются глюкозиды, галактозиды, рамнозиды, арабинозиды; из дисахаридов — рутиноза (6-L-L-рамнозидо-D-глюкоза). Среди трисахаридов, входящих в состав пигментов, можно отметить три линейных: гентиотриозид, глюкозилрамнозилглюкозид, арабинозилсамбубиозид и два разветвленных: 2-глю- козилрутиноза, 2-ксилозилрутиноза (Запрометов, 1993).
Широко распространены ацилированные антоцианы. При этом ацильный остаток присоединяется эфирной связью к одному из сахарных фрагментов (Nakatani et al., 1995). В качестве ацильных заместителей чаще всего выступают оксикоричные и оксибензойные кислоты. Например, 3,7,3’-триглюкозид цианидина, ацилированный двумя оксикоричными кислотами, кофейной и феруловой, обнаружен в цветках растений Zebrina pendula Schnizl; антоцианидин C2, извлеченный из цветов Matthiola incana (L.), в состав которого входят кофейная, синаповая и малоновая кислоты (Saito et al., 1995). В цветках колокольчиков был найден дважды ацилированный n-оксибензой- ной кислотой 3 ди {n-оксибензоил} рутинозидо-7-глюкозид пеларгонидина. Помимо оксикоричных и оксибензойных кислот, ацильными заместителями могут служить уксусная, янтарная, коричная, кумаровая, феруловая кислоты (Dougall et al., 1997). В цветках Clitoria ternatea L. содержится серия антоцианов, названных тернатинами, например А3. В их основе 3,5’,5’-триглюкозид дельфинидина, к которому присоединены несколько остатков D-глюкозы, малоновой, кофейной и n-ку- маровой кислот (Saito et al., 1995). Тернатины благодаря такой специфике строения представляют собой стойкие красители и могут быть использованы в пищевой промышленности.
Среди наиболее часто встречающихся антоцианов можно указать следующие: пеларгонин (3,5-диглюкозид пеларгонидина), содержащийся в гранате (Punica granatum L.), пеоне
(Paeonica suffrutikosa subsp. rockii), недотроге (Impatiens balsamina L.); хризантемин (3-моноглюкозид цианидина), содержа-
щийся в землянике (Fragaria vesca Coville), сливе (Prunus cera-
62
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
sus L.); цианин (3,5-диглюкозид цианидина), содержащийся в цветках василька, мака, розы (Запрометов, 1993).
Выделенные из растения антоцианы имеют красную или фиолетово-красную окраску. Например, пеларгонидин — оран- жево-красный, а цианидин — сине-красный (Гудвин, Мерсер, 1986). Долгое время считалось, что окраска антоцианов в тканях растений определяется величиной pH клеточного сока. Так, сдвиг pH клеточного сока в кислую сторону объяснял наличие красной окраски, в слабощелочную — синей, а преобладание в клеточном соке нейтральной pH отвечало за наличие фиолетовой окраски (Запрометов, 1993).
Но позднее было показано, что клеточный сок лепестков свыше 200 растений, принадлежащих к разным видам и семействам, имеет независимо от окраски одинаковое значение Ph = 5,5. В дальнейших исследованиях было установлено, что в формировании антоциановой окраски в тканях растений могут принимать участие фенольные соединения других классов и групп, ионы металлов, а в ряде случаев вещества не феноль-
ной природы (Malien-Aubert et al., 2001). По-видимому, натив-
ная окраска антоцианов в тканях растений определяется следующими факторами: строением агликона (причем увеличение степени гидроксилирования цикла В сдвигает окраску в синюю сторону, а увеличение степени метилирования — в красную) и комплексообразованием с ионами металлов (так, ионы Мо2+ и Ca2+ способствуют развитию синей окраски).
Например, пигмент, выделенный из экстракта цветов Centaurea cyanus L. (3,5-диглюкозид цианидина): ассоциация трехвалентного иона металла (Fe3+ или Al3+), связанного с двумя молекулами цианина и молекулой полигалактоуроновой кислоты. Коммелин (M6F6Mg2)2–, выделенный из экстракта цветов Commelina communis L.: два иона магния соединяют три подъединицы, каждая из которых образована расположенными друг на друге двумя молекулами ацилированного малоновой кислотой антоциана (малонилавобанин-М), окруженного двумя молекулами флавона (флавокоммелин F (4’-0-глюко-
зид свертизин)) (Kondo et al., 1992).
63
Глава 3
В усилении окраски антоциановых пигментов участвуют желтые пигменты — флавоны и флавонолы (Saito et al., 1995), а также иные фенольные соединения, такие как оксикоричная, кофейная, феруловая кислоты и их производные (Markovic et al., 2000).
Как уже было отмечено, в большинстве случаев антоцианы встречаются в форме гликозидов. Они представляют собой катион, гидролизуются медленнее, чем флавонолы и другие гликозиды, и в клетке существуют в виде солей с органическими кислотами (Giusti et al., 1999). По этой причине экстракцию
ивыделение антоцианов проводят в слабокислой среде. Чаще всего используют охлажденный метанол и этанол, содержащий 0,1—1 % соляной кислоты (Валуйко и др., 1980).
Следует отметить, что антоцианы растворимы в воде, спирте, но не растворяются в эфире, хлороформе, бензине (Гудвин, Мерсер, 1986). Выяснено, что в водных растворах они присутствуют в виде равновесной смеси четырех форм: хиноидное основание, флавилиевый катион, халконная форма
икарбинол (рис. 3.2).
Рис. 3.2. Формы антоцианов в растворах
64
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
Спектр поглощения антоцианов, выделенных из различных растений, охватывает в основном сине-фиолетовые (400— 420 нм) и зеленые (500—550 нм) лучи (Da Cunha Filho, Nascimento, 2000). Как и все флавоноиды, антоцианы, кроме того, имеют характерное поглощение в ультрафиолетовой области
(Giusti et al., 1999).
Совокупность литературных данных свидетельствует о том, что все растения образуют (в тех или иных количествах) фенольные соединения. Это, однако, не означает, что все органы и ткани растения синтезируют одинаковые фенольные соединения. Характерная антоциановая окраска чаще всего ограничивается лепестками, хотя у некоторых растений антоцианы придают окраску и листьям, пыльникам, семенам, стеблям и корням, не говоря уже о плодах и ягодах. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5—5 %, но иногда достигает 20 %, как, например, в цветках софоры японской. Показано, что специфическая окраска цветков, в которой принимают участие антоцианы, флавоны и халконы, привлекает внимание насе- комых-опылителей. При этом важна не только яркая, видимая окраска цветка, создаваемая главным образом антоцианами, но и поглощение этими пигментами УФ, поскольку многие насекомые, в частности пчелы, чувствительны к свету УФ-области спектра, что, по мнению некоторых ученых, сказывается на видообразовании и эволюции как растений, так и насекомых (Harborne, 1993).
С помощью электронной микроскопии, а также на изолированных вакуолях было установлено, что многие вторичные соединения накапливаются либо в одной центральной вакуоли, либо в нескольких более мелких. Специальные исследования локализации флавоновых соединений (Волынец, Прохорчик, 1983) показали, что флавоноиды образуются только в периферических частях и тканях растений, главным образом в эпидермисе, и это находится в прямой зависимости от про-
65
Глава 3
должительности действия видимого света. Сказанное справедливо и для антоцианов (Brouillard, 1993), причем в большинстве случаев их тканевая локализация ограничивается верхним эпидермисом (Woodall, Stewart, 1998; Markham, 2000). Расте-
ния, адаптированные к теневым условиям, обнаруживают присутствие данных пигментов в нижнем эпидермисе, возможно для боле полного и эффективного поглощения фотосинтетической радиации (Lee et al., 1987). Кроме того, описаны случаи локализации антоцианов исключительно в мезафильных тканях некоторых видов растений из родов Mahonia, Viburnum, Rhododendron (Kaku et al., 1992) и некоторых тропических древесных из рода Syzygium (Woodall et al., 1998).
Накопление антоцианов в специальных везикулах — антоцианопластах — происходит в клетках гипокотилей проростков редиса (Raphanus sativus L.) и нескольких других растений, а также в культивируемых клетках батата (Запрометов, 1993). Кроме того, антоцианы могут встречаться в кристаллическом виде, например в клеточном соке плодов апельсинов и в плазме некоторых луков. В гиподермальных клетках красной капусты (Brassica oleracea L.) центральная вакуоль содержит один антоцианопласт, окруженный трехслойной мембраной. C помощью специфических ингибиторов мембранных АТФаз на дисках из лепестков розы было выяснено, что поступление антоцианов в вакуоль происходит с участием АТФазы тонопласта (Запрометов, 1993).
Антоцианы синтезируются в цитоплазме и, как показывают электронно-микроскопические исследования, транспортируются в центральную вакуоль с помощью ограниченных мембраной микровезикул (антоцианопластов) (рис. 3.3). Однако по вопросу о месте возникновения таких микровезикул существуют разногласия. Одни авторы считают, что транспортные везикулы образуются при эвагинации оболочки пластид. Другие полагают, что место их образования — шероховатый эндоплазматический ретикулум (Запрометов, 1993).
66
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
Рис. 3.3. Схема образования и транспортирования антоцианов в клетке:
1 — халконсинтаза, 2 — дигидрофлавонолредуктаза, 3 — антоцианидинсинтаза, 4 — флавонол-3-0-гликозилтрансфераза,
5 — глютатион-S-трансфераза, 6 — лейкоантоцианидинредуктаза
Вакуоли клеток — не единственное место локализации флавоноидов. Имеются интересные данные по локализации многообразных фенольных соединений в других органоидах клетки. Например, в хлоропластах растений выявлены производные оксикоричных кислот, флавоны, флаваноны, катехины и антоцианы, т.е. практически все наиболее широко распространенные фенольные соединения листьев растений (Волынец, Прохорчик, 1983). Важные данные по определению отно-
67
Глава 3
сительного содержания флавоноидов приводятся для железистых клеток тополя черного (Воскресенская, 1965). Максимальное количество флавоноидов обнаружено в пластидах железистых клеток, находящихся на стадии созревания. В зрелых и старых клетках флавоноиды преобладали в вакуолях. А это может означать, что флавоноиды могут образовываться в пластидах и накапливаться в значительных количествах в вакуолях.
Вместе с антоцианами в растениях встречаются лейкоантоцианы, представленные бесцветными веществами, имеющими способность при нагревании в присутствии минеральных кислот превращаться в ярко окрашенные антоцианы. Одним из первых исследователей лейкоантоцианов был М.С. Цвет, на-
звавший их искусственными антоцианами. Позже эти соедине-
ния были выделены в отдельную группу — лейкоантоцианы, представляющие собой бесцветные, обычно аморфные соединения. Они хорошо растворимы в воде, этаноле, ацетоне, а при обработке разбавленной соляной кислотой переходят в соответствующие ярко окрашенные соли антоцианов.
Вместе с антоцианами в растениях встречаются флавоны и флаванолы, участвующие в создании так называемой антоциановой окраски, а также часто отмечаются высокоолигомерные и полимерные проантоцианидины А2 и В1, в состав которых входят антоцианы. Например, при гидролизе молекулы процианидина В1 образуется молекула цианидина и моле-
кула катехина (Laouenan et al., 1997).
Помимо димерных процианидинов, известны также димерные продельфинидины, в состав которых входит дельфинидин (Laouenan et al., 1997) и полимерные проантоцианидины — пигмент, извлеченный из околоплодника Litchi chinensis Sonn (Laouenan et al., 1997). Их принято относить к дубильным веществам — конденсированным проантоцианидинам. В растениях также встречаются представители класса халконов и флавонолов; благодаря наличию хромофорной группировки они окрашены в желтый цвет.
68
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
3.1.Биосинтез антоцианов
Внастоящее время процесс биосинтеза антоциановых пигментов хорошо изучен и открыто довольно много генов, которые непосредственно контролируют и регулируют так называемый антоциановый путь биосинтеза (Wang, Wessler, 2001). Мутации в антоциановых генах хорошо изучены вследствие их легкой идентификации и отсутствия вредного воздействия на рост и развитие клетки. Сейчас хорошо изучены три модификации биосинтеза антоцианов: биосинтез пигментов в растениях кукурузы (Zea mays L.), в растениях львиного зева (Snapdragon majus L.), и в гибридных растениях петунии. Следует отметить, что петуния раньше всех стала объектом для изучения антоциановых генов. Так, уже известно почти 35 генов, затрагивающих формирование цветочной окраски. Позднее, по мере развития генетики и ее методов, в качестве объектов для изучения стали использовать кукурузу и другие растения, синтезирующие флавоноиды.
Следует отметить, что путь биосинтеза антоцианов видоспецифичен. Так, у кукурузы, львиного зева и петунии начальный биосинтез состоит из общих реакций, но имеются некоторые важные различия между видами. Одно из них в том, что петуния обычно не производит пеларгонидин, в отличие от кукурузы и львиного зева, которые к тому же не способны синтезировать дельфинидин. Степень модификации антоцианов также видоспецифична. Растения способны синтезировать большое количество разнообразных ароматических соединений, содержащих в своих молекулах одно или несколько бензольных ядер. Для их образования используются два основных механизма: шикиматный путь, объединяющий в себе биосинтез ароматических аминокислот и начальные этапы биосинтеза фенольных соединений, в котором исходными соединениями служат продукты углеводного метаболизма (фосфоенолпируват и эритрозо-4-фосфат), и ацетатно-малонат-
69
Глава 3
ный (поликетидный) путь (Запрометов, 1993), в котором в качестве исходных соединений используется ацетил-КоА и мало- нил-КоА.
Предшественниками для синтеза всех флавоноидов, включая антоцианы, являются малонил-КоА и n-кумарил-КоА. Халконсинтаза катализирует пошаговую конденсацию трех ацетатных блоков от малонил-КоА с n-кумарил-КоА с получением тетрагидроксихалкона. Халконизомераза катализирует стереоспецифическую изомеризацию окрашенного в желтый цвет тетрагидрохалкона в бесцветный нарингенин. Нарингенин преобразуется в дигидрокемпферол флаванон-3-гидрокси- лазой (рис. 3.4).
Рис. 3.4. Биосинтез антоцианов: первый этап
Дигидрокемпферол может впоследствии быть гидроксилирован флавоноид-3’-гидроксилазой с получением дигидрок-
70