Природные антиоксиданты (экологический аспект). Монография

Ферментативная антиоксидантная система растений

ra: было установлено снижение активности каталазы при дефиците железа, однако дефицит цинка не оказывал существенного влияния на активность фермента (Nicholas, Goodman, 1958). Другие исследователи, напротив, отмечают существенное снижение активности каталазы при дефиците цинка (Cakmak, 2000).

В нашей работе проводилось изучение влияния селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). Максимальная активность каталазы отмечалась в растениях, выращенных на питательной среде, не содержащей ни селена, ни цинка, что может свидетельствовать о существенной роли именно данного фермента в утилизации пероксида водорода в условиях микроэлементного дефицита

(рис. 2.4).

Рис. 2.4. Влияние селена и цинка на активность каталазы в листьях ячменя

Кроме того, проводилось исследование влияния селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя и китайской капусты, подвергнутых действию света высокой интенсивности (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008). Результаты исследования представлены на рисунках 2.5 — 2.6.

31

Глава 2

Рис. 2.5. Влияние селена и цинка на активность каталазы в растениях капусты китайской на фоне окислительного стресса,

вызванного светом высокой интенсивности (I света = 680 мкмоль м–2 • с–1)

Рис. 2.6. Влияние селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 520 мкмоль м–2 • с–1).

32

Ферментативная антиоксидантная система растений

Как видно из представленных на рисунках 2.5—2.6 данных, при исключении из питательной среды цинка и селена активность каталазы в растениях капусты китайской и ячменя резко снижалась. Такой результат, вероятно, связан с тем, что при действии на растения нескольких неблагоприятных факторов — дефицита микроэлементов и света повышенной интенсивности — в их клетках образуется избыточное количест-

во О•2− . Известно, что каталаза очень чувствительна к супер-

оксидному радикалу, повышенный уровень которого может существенно инактивировать ее активность (Fridovich, 1986).

Действие тяжелых металлов

Изучение действия ионов свинца на активность антиоксидантных ферментов в листьях рдеста курчавого (Potamogeton crispus L.) показало уменьшение активности каталазы при возрастании концентрации свинца (от 0 до 50 мг/л). Установлена обратная корреляционная зависимость между активностью КАТ и концентрацией свинца (r = –0,984) (Ху и др., 2007).

При этом показано различие в ответной реакции каталазы на действие свинца для двух экотипов растений Sedum alfredii: экотипа, аккумулирующего тяжелые металлы, и неаккумулирующего экотипа. Растения выращивали на питательных растворах с концентрацией свинца от 0,02 до 0,2 ммоль/л. Активность КАТ в листьях растений экотипа, аккумулирующего тяжелые металлы, медленно возрастала с увеличением концентрации свинца. Однако у растений неаккумулирующего экотипа была отмечена противоположная тенденция: активность КАТ значительно снижалась после обработки свинцом (Лиу и др., 2008).

Исследовано влияние различных концентраций цинка (1—1000 мкмоль/л) на систему антиоксидантной защиты в корнях Sedum alfredii двух экотипов: гипераккумуляторов цинка и не аккумулирующих цинк растений. Для обоих экотипов

33

Глава 2

было установлено увеличение каталазы в корнях исследуемых растений при увеличении концентрации цинка до 500 мкМ и снижение активности фермента при более высоких концентрациях микроэлемента (Ли и др., 2008).

Изучалось влияние различных концентраций меди (50— 200 мкМ) на антиоксидантную систему растений горчицы индийской (Brassica juncea L.). Установлено значительное увеличение активности каталазы (на 30—106 %) в листьях исследуемых растений при обработке их медью (Деви, Прасад, 2005).

Вместе с тем было выявлено снижение активности каталазы более чем в 2 раза в листьях растений тыквы обыкновенной, выращенной на питательной среде, содержащей 10 мМ

(El-Shora, 2003).

Различия в ответной реакции растений на внесение меди могут быть связаны с использованием в эксперименте разных концентраций меди и видовой специфичностью растений.

Солевой стресс

Полученные данные по изменению активности каталазы в растениях с различной степенью солеустойчивости при увеличении концентрации хлорида натрия позволили некоторым авторам сделать вывод, что КАТ играет важную роль в детоксикации перекисей, образующихся при солевом стрессе (Ху, Лиу, 2008; Ясар и др., 2008). В этих работах наблюдали значительное повышение активности каталазы в растениях фасоли и топинамбура солеустойчивых сортов, в то время как в чувствительных к засолению сортах активность каталазы изменялась незначительно.

Также установлено, что изменение активности каталазы в листьях и корнях растений пшеницы при солевом стрессе зависит от азотного питания растений. Например, активность

КАТ падала в листьях NO3− -растений и достоверно не изменялась у NH+4 - и N-дефицитных. В корнях NH+4 -растений на-

34

Ферментативная антиоксидантная система растений

блюдали уменьшение активности фермента. В остальных вариантах активность каталазы достоверно не изменялась (Полесская и др., 2006).

2.3. Глютатионпероксидаза

Глютатионпероксидаза — ГПО (КФ 1.11.1.9), локализованная в цитоплазме, плазмалемме и матриксе митохондрий, разрушает пероксид водорода и органические гидропероксиды свободных жирных кислот, нуклеотидов, нуклеиновых кислот,

белков (3—4) (Чиркова, 2002; Kuehn, Borschert, 2002; Ursini et al., 1995):

H2O2 + 2GSH → 2Н2О + GSSG;

ROOH + 2GSH → ROH + Н2О + GSSG.

В активный центр глютатионпероксидазы входит селеноцистеин, который играет роль каталитического центра вышеописанных реакций, так как селенольная группа окисляется легче, чем тиольная. В связи с этим схема реакций детоксикаций гидроперекисей приобретает несколько иной вид (Пле-

менков, 2001):

Несмотря на то что физиологические функции и строение этого фермента для животных и человека установлены точно, вопрос относительно его роли и формы в растениях до сих пор не решен.

В клетках человека и животных было выявлено четыре изоформы ГПО, содержащие в активном центре микроэлемент селен, в том числе и фосфолипидгидроксипероксид-глютати- онпероксидазу (PH-ГПО), катализирующую в основном редукцию гидропероксидов фосфолипидов (Brigelius-Flohe et al., 1994). В некоторых высших растениях был выделен и описан

35

Глава 2

ген, идентичный гену PH-ГПО животных и человека (RoeckelDrevet et al., 1998; Depege et al., 1998).

В то же время было установлено, что ГПО имеет в растениях меньшую ферментативную активность по сравнению с животными. Это связано с тем, что активным центром в растительной ГПО является не селеноцистеин, а цистеин (Eshdat et al., 1997; Yoshimura et al., 2004).

Однако, несмотря на то что физиологическая роль ГПО в растениях не совсем ясна, существуют данные о реакции ГПО-системы на стрессовое воздействие на молекулярном уровне (Roeckel-Drevet et al., 1998; Depege et al., 1998; Tamas et al., 2006), а кроме того, выявлено повышение устойчивости трансгенных растений, трансформированных геном ГПО к окисли-

тельному стрессу (Yoshimura et al., 2004; Chen et al., 2004).

Антиоксидантная роль глютатионпероксидазы была установлена как при воздействии на растение абиотических, так и биотических стрессовых факторов (Navrot et al., 2006).

Влияние экологических факторов на активность глютатионпероксидазы

Свет

Несмотря на то что в последнее время активно исследуется ответная реакция антиоксидантной системы на стресс, вызванный светом высокой интенсивности, вопрос о роли глютатионпероксидазы в данных условиях остается малоизученным.

В нашей работе исследовалось действие света высокой интенсивности (I = 520 мкмоль м–2 • с–1) на активность глютатионпероксидазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). После 12-часовой световой экспозиции в исследуемых растениях было зафиксировано снижение уровня ГПО на 15 % по сравнению с контролем.

36

Ферментативная антиоксидантная система растений

Кроме того, изучалось действие света высокой интенсивности на активность глютатионпероксидазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных в условиях дефицита цинка (рис. 2.7) (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008).

Рис. 2.7. Влияние интенсивности света на активность глютатионпероксидазы в растениях ячменя

и капусты китайской, выращенных при дефиците цинка:

для ячменя: I1 = 160 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 520 мкмоль м–2 • с–1;

для капусты китайской: I1 = 290 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 680 мкмоль м–2 • с–1

Как видно из представленных данных, активность глютатионпероксидазы в листьях ячменя уменьшилась на 33 %, а в листьях капусты китайской на 29 % после облучения растений светом высокой интенсивности.

Минеральное питание

Изучено влияния селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). Несмотря на то что до сегодняшнего дня отсутствуют данные, подтверждающие наличие селенсодержащей глютатионпероксидазы в высших растениях, за последнее время получены многочисленные данные, свидетельствующие о повышении активности

37

Глава 2

ГПО под действием селена (Hartikainen et al., 2000; Xue et al., 2001; Xu et al., 2003; Seppaenen et al., 2003; Djanaguiraman et al., 2005). Полученные нами результаты подтвердили значительную роль селена в функционировании данного фермента. Максимальная активность ГПО была установлена в растениях ячменя, выращенных на питательной среде с добавлением селена (рис. 2.8). Активность глютатионпероксидазы в данных вариантах была практически в 1,5—2 раза выше.

Рис. 2.8. Влияние селена и цинка на активность глютатионпероксидазы в листьях ячменя

Кроме того, проводилось исследование влияния селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя и китайской капусты, подвергнутых действию света высокой интенсивности (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008).

Результаты проведенных экспериментов показали, что при исключении из питательной среды микроэлемента цинка активность глютатионпероксидазы в листьях капусты китайской снижалась примерно на 12 %, в листьях ячменя — на 9 % (рис. 2.9, 2.10). Наиболее высокая активность фермента наблюдалась в растениях, выращенных на питательной среде, содержащей селен. При этом селен проявлял положительное

38

Ферментативная антиоксидантная система растений

действие как при наличии цинка в питательной среде, так и — особенно — при его отсутствии.

–Se; +Zn –Se; –Zn +Se; –Zn +Se; +Zn

Рис. 2.10. Влияниеселенаицинканаактивностьглютатионпероксидазы врастенияхячменянафонеокислительногостресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 520 мкмоль м–2 • с–1)

39

Глава 2

2.4. Ферменты аскорбат-глютатионового цикла

Аскорбатпероксидаза — АПО (КФ 1.11.1.11), присутствуя в растениях в нескольких изоформах, участвует в реакции восстановления пероксида водорода аскорбиновой кислотой в хло-

ропластах(Groden, Beck, 1979; Nakano, Asada, 1981; Shigeoka et al., 2002; Mittler, 2002). В результате данной реакции образуется монодегидроаскорбат, который спонтанно диспропорционирует с образованием аскорбата и дегидроаскорбата. А также он может ферментативно восстанавливаться НАД(Ф)Н-зависимой монодегидроаскорбатредуктазой до аскорбиновой кислоты. Образовавшийся дегидроаскорбат под действием дегидроаскорбатредуктазы взаимодействует с восстановленным глютатионом и превращается в аскорбиновую кислоту. Окисленный глютатион регенируется глютатионредуктазой. Таким образом, аскорбатпероксидаза вместе с другими компонентами аскорбат-глюта- тионого цикла эффективно защищает клетки от токсического действия избыточных количеств Н2О2 (Asada, 1992; Mittler, 2002). Кроме того, тилакоидно-связанная АПО участвует в водно-вод- ном цикле по утилизации АФК (Asada, 1999).

Всего в растениях выявлено четыре изоформы АПО: две формы, находящиеся в хлоропластах (тилакоидно-связанная аскорбатпероксидаза (тАПО) и растворенная в строме (сАПО)), а также связанная с микротелами (в том числе глиоксомами и пероксисомами) аскорбатпероксидаза (мАПО) и цитозольная аскорбатпероксидаза (цАПО) (Chen, Asada, 1989; Miyake et al., 1993; Yamaguchi et al., 1995; Bunkelmann, Trelease, 1996; Ishikawa et al., 1996, 1998).

Дегидроаскорбатредуктаза — ДГАР (КФ 1.8.5.1) — важный элемент ферментативной антиоксидантной системы растений, участвующий в аскорбат-глютатионовом цикле по ликвидации излишних количеств АФК. ДГАР восстанавливает дегидроаскорбат в аскорбиновую кислоту, используя в качестве донора электрона восстановленный глютатион (Hossain, Asada, 1984). В отличие от остальных ферментов, участвующих в ликвидации Н2О2, ДГАР изучена плохо, что частично может быть объяснено ее низкой стабильностью (Truemper et al.,

40