Природные антиоксиданты (экологический аспект). Монография

Ферментативная антиоксидантная система растений

новлено, что активность СОД в исследуемых растениях достоверно не изменялась по сравнению с контрольными значения-

ми (Gechev et al, 2003).

Изучено действие света повышенной интенсивности (I = 200 мкмоль м–2 • с–1) на активность ферментов антиоксидантной системы в растениях Arabidopsis thaliana (L.). Достоверного изменения активности супероксиддисмутазы при увеличении интенсивности света в 2 раза авторами работы выявлено не было. Вместе с тем установлено резкое повышение активности супероксиддисмутазы при облучении растений УФ-светом (0,25 Вт м–2) (Kubo et al., 1999).

В нашей работе проводилось изучение ответной реакции антиоксидантной системы растений ячменя при облучении их светом высокой интенсивности (I = 520 мкмоль м–2 • с–1) в течение 12 часов. Было установлено повышение активности СОД в растениях после 12-часовой световой экспозиции на 12 % по сравнению с контрольным вариантом (Скрыпник, Чупахи-

на, 2008).

Температура

Влияние температуры на активность супероксиддисмутазы неоднозначно и зависит не только от продолжительности действия фактора, его интенсивности, но и от вида исследуемого растения.

Так, изучалось действие низких отрицательных температур (–9 °С, 15 минут) на развитие окислительного стресса и активность супероксиддисмутазы в растениях картофеля. Было установлено значительное повышение активности СОД в листьях картофеля при гипотермии (Демина и др., 2008). Повышение активности супероксиддисмутазы выявлено и в листьях ячменя в условиях низкотемпературного стресса (2 °С, 24 часа) (Радюк и др., 2009). Было установлено, что общая активность СОД в условиях низкотемпературного стресса превышала ис-

21

Глава 2

ходное значение на 15 %. После окончания действия холодового фактора общая активность СОД медленно снижалась, возвращаясь к исходной величине (через 48 часов). Анализ изоформ СОД показал, что активность цитоплазматической CuZnСОД в ответ на низкотемпературный стресс увеличилась на 15 %, в то время как активность хлоропластной CuZnСОД возрастала только на 9 %. Исследование динамики активности цитозольной СОД в листьях картофеля в условиях длительной гипотермии показало, что в 1-е сутки у растений наблюдается всплеск активности СОД, на 3-и сутки происходит резкий спад и последующее незначительное увеличение активности фермента к окончанию опыта (на 6-е сутки) (Дерябин и др., 2007).

Вместе с тем некоторые авторы отмечают снижение активности супероксиддисмутазы или отсутствие реакции фермента при действии на растения низких температур. Так, изучение изменения активности супероксиддисмутазы в растениях табака при охлаждении до 2 °С в течение 2 часов показало, что уже через 30 минут после начала охлаждения активность СОД резко снижается. Самое значительно уменьшение активности (в 4 раза) наблюдалось в растениях табака спустя 1 час после охлаждения. После 2 часов выдерживания при пониженной температуре активность СОД несколько возрастала, но все же оставалась значительно ниже исходного (до охлаждения) уровня (Попов и др., 2006).

Было проведено исследование изменения активности антиоксидантных ферментов в динамике охлаждения в растениях с различной степенью холодоустойчивости. Самое значительное снижение активности (более чем в 6 раз) наблюдали в листьях огурца — наиболее теплолюбивого из всех исследуемых в данном опыте растений (Лукаткин, 2002).

Минеральное питание

Наряду со светом и температурой основным фактором, влияющим на активность супероксиддисмутазы, является минеральное питание. Исходя из строения СОД, естественным

22

Ферментативная антиоксидантная система растений

будет предположить, что дефицит в питательной среде меди, цинка, железа и марганца существенно повлияет на активность супероксиддисмутазы.

Изучалось влияние дефицита меди, цинка и марганца на общую активность супероксиддисмутазы и активность ее отдельных изоформ (MnСОД, FeСОД, CuZnСОД) в листьях люпина. Установлено, что дефицит меди приводил к снижению общей активности СОД и активности всех изучаемых изоформ. При исключении из питательного раствора цинка снижалась общая активность СОД и активность MnСОД и CuZnСОД, а активность FeСОД достоверно не изменялась. При дефиците марганца, напротив, общая активность супероксиддисмутазы и активность MnСОД, CuZnСОД повышались, а активность FeСОД понижалась по сравнению с контрольным вариантом (Yu, Rengel, 1999). Увеличение общей активности супероксиддисмутазы при дефиците марганца отмечалось также в хвое ели обыкновенной (Polle et al., 1992).

Также исследовалось влияние дефицита магния на активность супероксиддисмутазы в листьях фасоли. Уровень активность СОД в растениях, выращенных на питательной среде, не содержащей магний, был ниже по сравнению с контрольным вариантом. При этом снижение общей активность СОД происходило, главным образом, за счет уменьшения активности

CuZnСОД (Cakmak, Marschner, 1992).

Нами проводилось изучение влияния селена и цинка на суммарную активность супероксиддисмутазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). В опыте использовали четыре группы растений: 1) растения, выращенные на среде с добавлением селена; 2) растения, выращенные на среде с добавлением цинка; 3) растения, выращенные на среде с добавлением селена и цинка; 4) растения, выращенные на среде, не содержащей ни селена, ни цинка. Селен добавлялся в форме селената натрия в концентрации 1 мкмоль/л, цинк — в форме хлорида цинка в концентрации 2 мкмоль/л.

23

Глава 2

Как показали исследования, исключение цинка из питательной среды приводило к снижению активности СОД более чем в 2 раза (рис. 2.1).

Рис. 2.1. Влияние селена и цинка на активность супероксиддисмутазы в листьях ячменя

Добавление селена в питательный раствор способствовало повышению СОД по сравнению с Zn-дефицитным вариантом, однако и в этом случае активность СОД была примерно в 1,5 раза меньше, чем у растений, выращенных на питательной среде, содержащей цинк. Кроме того, установлено снижение активности супероксиддисмутазы в растениях, выращенных при наличии в питательной среде и цинка, и селена.

Действие тяжелых металлов

Загрязнение почвы, воды и воздуха тяжелыми металлами представляет большую опасность для биосферы. Устойчивость растений к действию токсикантов во многом зависит от эффективности работы антиоксидантной системы. Как показа-

24

Ферментативная антиоксидантная система растений

ли исследования, реакция супероксиддисмутазы на действие тяжелых металлов может быть различной. Например, изучалось действие ионов свинца на активность антиоксидантных ферментов в листьях рдеста курчавого (Potamogeton crispus L.). Растения обрабатывали раствором нитрата свинца в различных концентрациях (от 0 до 50 мг/л). В результате эксперимента была установлена обратная корреляционная зависимость между активностью СОД и концентрацией свинца (r = –0,969) (Ху и др., 2007).

В другой работе изучали влияние свинца на рост, активность антиоксидантных ферментов и ультраструктуру листьев у двух экотипов, растений Sedum alfredii: экотипа аккумулирующего тяжелые металлы, и неаккумулирующего экотипа. Растения выращивали в лабораторных условиях на питательных растворах с концентрацией свинца от 0,02 до 0,2 ммоль/л. У растений экотипа, аккумулирующего тяжелые металлы, активность СОД возрастала с увеличением концентрации свинца. У растений неаккумулирующего экотипа активность СОД также увеличивалась соответственно увеличению уровня свинца, но до тех пор, пока его концентрации была менее 0,2 ммоль/л, затем активность фермента снижалась (Лиу и др., 2008).

Проведено исследование влияния различных концентраций цинка (1—1000 мкмоль/л) на систему антиоксидантной защиты в корнях Sedum alfredii двух экотипов: гипераккумуляторов цинка и не аккумулирующих цинк растений. В корнях растений-гипераккумуляторов при повышенных концентрациях цинка (от 250 мкмоль/л) наблюдали значительную активацию ферментативной активности. Активность СОД в корнях растений экотипа, не аккумулирующего тяжелые металлы, находившихся на растворах, содержавших до 250 мкмоль/л цинка, повышалась, а при более высоких концентрациях резко снижалась: при 1000 мкМ снижение составляло 29,8 % по сравнению с контролем (Ли и др., 2008).

Изучалось влияние различных концентраций меди (50— 200 мкМ) на антиоксидантную систему растений горчицы индийской (Brassica juncea L.). В ходе проведенного исследова-

25

Глава 2

ния была установлена положительная корреляционная зависимость между концентрацией меди и активностью супероксиддисмутазы как в корнях, так и в листьях исследуемых растений. В листьях активность СОД возрастала на 9—16 %, в корнях на 8—27 % (Деви, Прасад, 2005).

Также изучалось действие различных концентраций (10— 1000 мкМ) ряда тяжелых металлов (Cr, Cd, Cu, Zn) на активность супероксиддисмутазы в растениях гидриллы (Hydrilla verticillata (Linne f.) Royle). Активность супероксиддисмутазы повышалась в растениях под действием кадмия и меди и понижалась под действием цинка и хрома соответственно увеличению концентрации тяжелых металлов (Panda, Khan, 2004).

Солевой стресс

В настоящее время большое внимание уделяется выяснению роли антиоксидантных систем в устойчивости растений к солевому стрессу.

Было установлено, что при солевом стрессе активность супероксиддисмутазы в листьях пшеницы незначительно возрастает. В корнях солевой стресс не вызывал достоверного изменения в активности СОД (Полесская и др., 2006). Увеличение активности фермента в листьях различных видов растений при солевом стрессе было выявлено и в других работах (Карташавов и др., 2008; Ху, Лиу, 2008).

2.2. Каталаза

Каталаза — КАТ (КФ 1.11.1.6) — гемсодержащий тетрамерный фермент, катализирующий реакцию превращения пероксида водорода в воду:

2H2O2 → 2Н2О + О2.

В отличие от других ферментов, способствующих ликвидации пероксида водорода, КАТ не требует дополнительного субстрата.

Каталаза — основной фермент, ликвидирующий избыточные количества пероксида водорода, однако вследствие

26

Ферментативная антиоксидантная система растений

низкого сродства к субстрату она эффективна только при высоких концентрациях H2O2 (Baker, Orlandi, 1995). При низких концентрациях пероксида водорода каталаза способна катализировать его восстановление только при наличии дополнительных доноров водорода, например этанола, муравьиной или аскорбиновой кислот.

Каталаза содержится во всех аэробных организмах. В растениях было определено несколько ее изоформ, которые локализованы преимущественно в пероксисомах клетки, однако они могут находиться и в ассоциированном с пластидами или митохондриями состоянии (Willekens et al., 1995).

В растениях табака (Nicotiana plumbaginifolia) было вы-

делено три гена, кодирующих каталазы (Willekens et al., 1994). КАТ1 является наиболее распространенной формой в фотосинтетически активных тканях и участвует в ликвидации пероксида водорода, образующегося при фотодыхании (Streb, Feierabend, 1996). КАТ2 наиболее активно проявляет свои функции в тканях сосудов, при этом ее активность быстро возрастет под действием диоксида серы, озона или УФ-излу- чения (Willekens et al., 1994). В связи с этим был сделан вывод о защитной роли КАТ2 от окислительного стресса, однако ее физиологические функции в растениях и точное место локализации (пероксисомы или митохондрии) установлены не были

(Chamnongpol et al., 1996). КАТ3 участвует в детоксикации

H2O2, образующегося в глиоксомах при разрушении жирных кислот.

Влияние экологических факторов на активность каталазы

Свет

Реакция каталазы на стресс, вызванный светом высокой интенсивности, может быть различной и зависит от продолжительности действия стрессового фактора и вида растения.

Изучение действия света высокой интенсивности (I = = 360 мкмоль м–2 • с–1) на активность антиоксидантных фер-

27

Глава 2

ментов в растениях табака показало, что на начальном этапе действия стрессового фактора (1—2-й день) активность каталазы снижалась более чем на 20 % по сравнению с контрольным вариантом. Затем активность фермента повышалась и на 4-й день эксперимента была выше контрольного значения на

13 % (Gechev et al., 2003).

Похожий результат был получен и в другой работе, авторы которой изучали изменение антиоксидантного статуса листьев бегонии при акклиматизации растений к высокоинтенсивному свету. Установлено, что активность каталазы снижалась в течение 24 часов после начала световой экспозиции более чем на 50 %, однако уже через 72 часа активность фермента достигала уровня контроля. Более длительное экспонирование растений бегонии на свету приводило к увеличению активности каталазы более чем в 2 раза по сравнению с контро-

лем (Burritt, Mackenzie, 2003).

Изучалось действие УФ-света на активность антиоксидантной системы растений перца. Было показано увеличение активности каталазы в листьях перца на 32, 183 и 184 % при облучении растений УФ-А, УФ-В и УФ-С соответственно (Махдавиан и др., 2008).

В нашей работе проводилось изучение ответной реакции антиоксидантной системы растений ячменя при облучении их светом высокой интенсивности (I = 520 мкмоль м–2 • с–1) в течение 12 часов (Скрыпник, Чупахина, 2007). В ходе проведенного исследования было установлено повышение активности каталазы в растениях после 12-часовой световой экспозиции на 45 % по сравнению с контрольным вариантом.

Вместе с тем исследование действия света высокой интенсивности на активность каталазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных в условиях дефицита цинка, показало снижение активности фермента после 12-часо- вой световой экспозиции (рис. 2.3) (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008).

28

Ферментативная антиоксидантная система растений

Рис. 2.3. Влияние интенсивности света на активность каталазы в растениях ячменя и капусты китайской,

выращенных при дефиците цинка:

для ячменя: I1 = 160 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 520 мкмоль м–2 • с–1;

для капусты китайской: I1 = 290 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 680 мкмоль м–2 • с–1

Как видно из представленных данных, активность каталазы в листьях ячменя уменьшилась на 32 %, в листьях капусты китайской на 11 % после облучения растений светом высокой интенсивности.

Температура

В последнее время появились многочисленные исследования влияния низких положительных температур на активность антиоксидантных ферментов, в том числе и каталазы. Однако полученные данные еще раз доказывают неспецифичность реакции антиоксидантной системы на действие стрессовых факторов. Например, исследовалось действие низких положительных температур (2 °С, 24 часа) на активность антиоксидантных ферментов растений с различной степенью холодоустойчивости. Активность каталазы у изученных видов до охлаждения была различной: наибольшей — в зеленых листьях

29

Глава 2

кукурузы, значительно меньшей — в листьях огурца и проса, самой малой — в этиолированных листьях кукурузы и побегах картофеля.

В ходе охлаждения наблюдались изменения активности фермента, неодинаковые у разных растений. Так, в начале охлаждения (через 1 час) активность каталазы в зеленых листьях кукурузы снижалась на 28 %, у огурца — на 50 %; в этиолированных листьях кукурузы и проса она не менялась, а в побегах картофеля увеличивалась на 50 % по сравнению с контролем. Через 4 часа охлаждения активность фермента изменялась: восстанавливалась у кукурузы, проса и картофеля и снижалась у огурца. К окончанию холодовой экспозиции (24 часа) активность каталазы у наиболее устойчивых видов (проса и картофеля) превышала контроль, у менее устойчивого вида (кукурузы — как зеленой, так и этиолированной) была на уровне контроля, у самого чувствительного вида (огурца) снижалась по сравнению с контролем (Лукаткин, 2002).

Незначительное увеличение активности каталазы наблюдалось в листьях растений табака, подвергнутых действию низкотемпературного стресса (2 °С, 2 часа) (Попов и др., 2006). Имеются, однако, данные о снижении активности каталазы в листьях табака при действии на растения низких положительных температур (5 °С, 4 дня) (Gechev et al., 2003). Различия в полученных результатах объясняются, скорее всего, разной продолжительностью действия стрессового фактора.

Минеральное питание

Реакция каталазы на дефицит макро- и микроэлементов может быть различной. Например, было выявлено увеличение активности каталазы на 154 % в листьях фасоли, выращенной при дефиците магния (Cakmak, Marschner, 1992). Вместе с тем в другом исследовании наблюдалось снижение активности каталазы в цитрусовых при дефиците железа в питательной среде (Chouliaras et al., 2004). Аналогичный результат был получен и в работе, посвященной изучению влияния дефицита железа и цинка на активность некоторых ферментов в Neurospo-

30