Природные антиоксиданты (экологический аспект). Монография
.pdf
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
верцитина или флавоноид-3’, 5’-гидроксилазой с получением дигидромирицитина. Флавоноид-3’, 5’-гидроксилаза может также преобразовывать дигидрокверцитин в дигидромирицитин. Требуется по крайней мере три фермента для преобразования бесцветных дигидрофлавонолов (дигидромирицитин, дигидрокверцитин, дигидрокемпферол) в антоцианы. Первое из этих ферментативных преобразований — превращение дигидрофлавонолов в лейкоантоцианидины (дигидрофлавонол редуктаза). Дальнейшее окисление, дегидратация и глюкозидирование лейкоантоцианидинов (флаван-3, 4-цис-диолов) приводит к образованию кирпично-красного пеларгонидина, красного цианидина и синего дельфинидина (Bruce et al., 2000) (рис. 3.5).
Рис. 3.5. Биосинтез антоцианов: второй этап
Однако механизм и ферменты, катализирующие эти реакции, не полностью известны до сего дня. Последний шаг в биосинтезе данных веществ — гликозидирование в положении
71
Глава 3
3’ — осуществляется антоцианидин/флавонол-3—0-глюкозил- трансферазой, что существенно стабилизирует молекулу.
Кроме пути биосинтеза в настоящее время изучается генная регуляция ферментов пути биосинтеза. Так, на примере растений кукурузы была показана способность к регуляции некоторых ферментов локусом R. Халконсинтаза кодируется С2-областью. Дигидрофлавонол-4-редуктаза, флавоноид-3-глю- козилтрансфераза и дигидрофлавонолредуктаза кодируется А1-доменом. Флавонол-3—0-глюкозилтрансфераза и флаво- ноид-3-глюкозилтрансфераза, кодируется Bz1-областью. Фла- вонол-3—0-глюкозилтрансфераза или флавоноид-3-глюкозил- трансфераза переводят пеларгонидин и цианидин в пеларгони- дин-3-глюкозид и цианидин-3-глюкозид соответственно (Lesnick, Chandler, 1998; Selinger, Chandler, 1999). Регулирование антоцианового синтеза в кукурузе, кроме того, требует наличия двух факторов транскрипции: классы B и R, содержащий bHLH область, и классы C1 и P1, содержащий область Myb. Локус А2 в кукурузе к тому же может кодировать диоксигеназы. Это может означать, что антоцианидинсинтаза может практически предоставлять лейкоантоцианидиндиоксигеназу, которая в растениях рода Arabidopsis ответственна за преобразование лейкопеларгонидина в пеларгонидин и лейкоцианидина в цианидин. Выяснено, что в растениях этого рода дигидрофлавонолредуктаза кодируется tt3-локусом; флавонолсинтаза кодируется участком tt6; халконсинтаза — tt4; флавоноид 3-гидроксилаза — tt7, где tt относят к прозрачным тест мутантам (Rohdea et al., 2000). Другой ген — Bz2 — в растениях кукурузы может кодировать глютатион-S-трансферазу, которая выполняет последний генетический шаг в биосинтезе антоцианов — маркировку цианидин-3-глюкозида глютатионом при транспортировке в вакуоль через тонопласт (Mueller et al., 2000). Эквивалент этого локуса (Bz 2) у растений рода петуния — An 9, но, в отличие от него, он кодирует не 3-й тип фермента глютатион-S-трансферазы, а 1-й тип глютатион-S-трансферазы
(De Vetten et al., 1999).
72
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
3.2. Физиологическая роль антоцианов
Уже давно высказывались предположения о защитной роли фенольных соединений, но экспериментальные доказательств этого долгое время не было. Лишь сравнительно недавно на примере суспензионной культуры клеток Rosa damascena Mill. было показано, что если проводить селекцию на устойчивость к облучению УФ, то выживать будут те клетки, которые способны синтезировать повышенное количество фенольных соединений, в частности антоцианов. При этом приобретшие устойчивость к облучению клетки не только содержали примерно в 15 раз больше флавоноидов, но и имели вдвое большее количество ДНК (Запрометов, 1993), а это означает, что антоцианины могут быть вовлечены в так называемую систему УФ-толерантности — как молекулы, экранирующие УФ.
Имеются данные о том, что эпидермальные флавоноиды могут выступать в качестве экрана, рассеивающего вредное УФ-излучение в вечнозеленых зрелых листьях (Day et al., 1994). Мезофильные флавоноиды также являются важными компонентами защитной системы, способной поглощать УФ-из- лучение, особенно в течение роста и развития листа, когда УФ-радиация не может быть полностью нивелирована еще не до конца сформированной кутикулой и эпидермисом (DeLucia et al., 1992). Ацилирование ароматическими или органическими кислотами увеличивает поглощение в УФ-области за счет возникновения максимума поглощения при 310—320 нм в результате наложения спектров кислот и основы антоциана. Хотя значимость антоцианов в этих процессах некоторыми исследователями ставится под большое сомнение (Chalker-Scott, 1999) вследствие имеющихся данных об отставании накопления антоцианов от синтеза более эффективных основных экранирующих молекул-флавоноидов, например гидроксикоричных кислот и других, в течение периода развития листовой пластинки (Gould et al., 2000).
73
Глава 3
Резистентность растений к УФ-стрессу основана на фоторепарировании (фотовосстановлении) ущерба, нанесенного этим излучением, или при ослаблении УФ. Последняя стратегия включает в себя уплотнение кутикулы, клеточных стенок, инкорпорацию фенольных смол в клеточные стенки, включая лигнин и увеличение опушенности (Johanson et al., 1995). Входит ли в эту стратегию обнаруженная активация биосинтеза антоциановых пигментов в ювенильных листьях и растительных тканях, подверженных свету высокой интенсивности, пока еще не ясно.
Сообщается, что зрелые листья красной разновидности рода Coleus, содержащие эпидермальные антоцианы, были подвержены меньшему повреждению УФ-В и УФ-С, чем их зеленые аналоги, не содержащие антоцианов (Burger, Edwards, 1996). Показано, что ДНК растений кукурузы, содержащих флавоноиды, преимущественно антоцианы (Stapleton, Walbot, 1994), была защищена в большей степени от вредного воздействия УФ-излучения, чем ДНК растений — генетических мутантов, не способных синтезировать данные соединения. Сходные данные были получены на мутантных растениях из рода Arabidopsis (Li et al., 1993). М. Хада (Hada, 1996) связы-
вал уменьшение уровня антоцианов в проростках Sorghum bicolor (L.) Moench с увеличением повреждения ДНК, освещенных УФ. Имеются данные, что антоцианины могут предохранять суспензии клеточных культур Centaurea cyanus L. от вредного воздействия УФ (Takahashi et al., 1991). Отмечено (Gitz et al., 1998) большее повреждающее действие УФ на растения, обработанные ингибитором фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) по сравнению с необработанными растениями. Хотя в этих исследованиях подобный эффект мог бы быть достигнут в большей степени за счет уменьшения других, более эффективных, чем антоцианины флавоноидных молекул. Следует отметить, что исследования в поддержку гипотезы экранирования клетки от УФ проводились на растениях, содержащих ацилированные оксикоричными кислотами (Burger, Edwards,
74
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
1996) или ароматическими кислотами антоцианы (Stapleton, Walbot, 1994).
Противоположные данные были получены Беггсом и Веллманном (Beggs, Wellmann, 1985), которые не обнаружили поглощения антоцианов, выделенных из растений кукурузы в УФ-области спектра, и, следовательно, не нашли твердых доказательств в подтверждение гипотезы УФ-защиты. Сторонники этой точки зрения констатируют, что антоцианы часто встречаются в очень низких концентрациях по сравнению с другими УФ-поглощающими компонентами и нуждаются в очень длинных световых экспозициях УФ для активации их биосинтеза (Brandt et al., 1995).
Гипотеза вовлеченности антоцианов в защитный механизм, экранирующий вредное УФ-излучение, предполагает их специальную тканевую локализацию внутри листовой пластинки. К примеру, для эффективного экранирования от вредного УФ-излучения, а также света высокой интенсивности нижележащих тканей данные пигменты должны быть локализованы либо в верхнем эпидермисе, либо в гиподерме листа. В большинстве случаев тканевая локализация антоцианинов ограничивается верхним эпидермисом (Johanson et al., 1995; Woodall, Stewart, 1998), хотя некоторые растения, адаптированные к теневым условиям, содержат данные пигменты в нижнем эпидермисе (Lee et al., 1987). Ювенильные листья манго (Mangifera indica L.) содержат антоцианы в клеточных слоях, примыкающих к нижнему эпидермису, в концентрациях, не свидетельствовующих в пользу выполнения данными пигментами сколько-нибудь значимой экранирующей роли (Lee et al., 1987). Имеются данные о присутствии антоциановых пигментов в высокой концентрации в палисадном мезофилле некоторых видов растений из родов Mahonia, Viburnum, Rhododendron (Kaku et al., 1992) и некоторых тропических древесных из рода Syxygium (Woodall et al., 1998).
Таким образом, различная локализация антоциановых пигментов в растительных тканях не предполагает их узкой
75
Глава 3
специализации в области защиты от действия УФ или света высокой интенсивности и, следовательно, говорит о более широком их участии в обменных процессах, а не только в защите растений от УФ.
Хотя химическая структура антоцианинов важна в определении их потенциальной роли, не менее значимо их содержание относительно других УФ-поглощающих компонентов.
В листьях Coleus (Burger, Edwards, 1996), Zea mays L. (Stapleton, Walbot, 1994) и в клеточных культурах Centaurea cyanus L. (Takahashi et al., 1991) антоцианы были главными УФ-погло- щающими компонентами, в отличие от ювенильных листьев рода Syzygium, где антоцианы составляли очень небольшую часть от общего УФ-поглощающего комплекса: S. luehmannii — 3,4 %; S. wilsonii — 5,5 % (Woodall, Stewart, 1998).
Имеются данные о том, что антоцианы могут непосредственно нейтрализовывать АФК: Н2О2, O−2 , 1О2, образующиеся
вследствие фотосинтетических процессов в хлоропластах по типу, сходному с α-токоферолом и каротиноидами (Ehlenfeldt, Prior, 2001). Однако локализация антоцианов в вакуолях не позволяет им напрямую выполнять эту функцию, ограничивая область их деятельности в пределах вакуоли и частично клеточной стенки.
В отличие от других активных видов кислорода, перекись водорода стабильна и способна к распространению через мембранные структуры. Несмотря на относительно слабую токсичность и даже пользу в нейтрализации вирусов и бактерий, в присутствии супероксидного радикала перекись индуцирует образование высокореактивного гидроксильного радикала. Таким образом, нейтрализация Н2О2 антоциановыми пигментами позволяет избежать сильного окислительного стресса, возникающего в результате действия неблагоприятных условий или интенсивного метаболизма в период роста (ювенильные ткани). К тому же отсутствие аскорбатпероксидазы в вакуолях клеток не позволяет участвовать аскорбиновой кислоте в де-
токсикации АФК (Yamasaki et al., 1996).
76
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
В связи с этим Х. А. Ямасаки (Yamasaki, 1997) была предложена схема флавоноид-пероксидазной системы для детоксикации водородного пероксида в вакуолях:
2FlavOH +H2O2 → 2 FlavO• + 2H2O (флавоноид пероксидаза).
Образующийся флавоноидный феноксильный радикал (FlavO•) может реагировать с аскорбиновой кислотой (АК) с образованием радикала монодегидроаскорбиновой кислоты МДАК., который претерпевает обратное изменение, превращаясь в АК и ДАК. Последняя также повышает уровень АК под влиянием дегидроаскорбатредуктазы:
2 FlavO• + 2АК→ 2FlavOH + 2МДАК•
2МДАК• → АК + ДАК ДАК → АК (дегидроаскорбатредуктаза)
H2O2 + АК → 2H2O + ДАК.
Полагают, что свободные радикалы аскорбата и флавоноидов выполняют важную биологическую функцию, реагируя с деструктивными свободными радикалами, причем наличие флавоноидной системы значительно повышает эффективность антиокислительной функции АК (Yamasaki et al., 1997; Девис и др., 1999). Так, изучение экстракции антоциановых пигментов на предмет их антиокислительной способности, основанное на окислении линолевой кислоты и коллагена, показало, что антоцианы нейтрализовали свободные радикалы настолько быстро, что последние не имели никакого шанса воздействовать на коллаген и показали значительное антиокислительное действие в пределах нескольких часов с линолевой кислотой (Monboisse, 1983).
Способность разрушать супероксидный радикал по типу флавонолов (наличие свободных гидроксильных групп определяет реакционную способность) позволяет функционировать антоцианам как эндогенным антиоксидантам, уменьшающим кислородно-радикальную токсичность, и наравне конкурировать с СОД, а также дополнять или компенсировать недоста-
77
Глава 3
ток таких эндогенных антиоксидантов, как АК, глютатион или флавонолы, выступая в качестве донора электронов для пероксидазной реакции (Yamasaki et al., 1996). Уровень антоциановых пигментов может также использоваться в качестве инди-
катора для определения уровня O•2− или активности СОД (Ya-
masaki et al., 1996).
Кроме того, некоторыми учеными показана защитная, антиокислительная роль антоцианов в предотвращении и профилактике заболеваний, возникающих в результате окислительного стресса, включая рак и старение, причем без побочных эффектов (Robert, 1990; Meiers et al., 2001).
Имеются данные (Курсанов, 1988), что иммунитет растений к любым заболеваниям может определяться количеством органических и ароматических кислот в клеточном соке, в частности дубильными веществами и антоцианами. Чем больше этих веществ содержится в соке растений, тем устойчивее растение к заболеваниям. Кроме того, на примере возбудителя коричневой гнили плодов Sclerotinia fructigena (Pers.) Schrot
было отмечено фунгицидное действие некоторых проантоцианидинов, в состав которых входят антоцианы.
Уже давно накапливались данные о том, что растения не только синтезируют флавоноиды, но и обладают способностью к их глубокому катаболизму. О такой способности можно судить по изменению в растениях содержания тех или иных фенольных соединений в ходе вегетации растений. Например, в репродуктивных органах во время цветения после вспышки биосинтеза флавоноидов часто наблюдается уменьшение их содержания или даже полное исчезновение. Внешне это иногда можно наблюдать по обесцвечиванию антоциановой пигментации в лепестках цветков. В процессе созревания плодов также нередко происходит устранение вяжущего вкуса, который обычно придают плодам проантоцианидины. Оказалось также, что проростки кукурузы подвергают интенсивному катаболизму введенный в них 14С-цианидин (Запрометов, 1993).
Основным механизмом запасания энергии в клетке служит локализованный в митохондриях процесс окислительного
78
Антоцианы — природные антиоксиданты растений
фосфорилирования. Так, в экспериментах с митохондриями, выделенными из гипокотилей кукурузы, было отмечено слабое разобщающее действие антоцианов на окислительное фосфорилирование (Запрометов, 1993).
Данных о влиянии флавоноидов, в особенности антоцианов, на процессы в хлоропластах in vitro, и тем более об участии этих фоторецепторов в процессах фотосинтеза in vivo, мало. Имеющиеся материалы побуждают к новым экспериментам и развитию представлений о флавоноидах как эндогенных регуляторах энергетического обмена хлоропластов.
Появилось основание считать антоцианы эффективными стимуляторами электронного транспорта хлоропластов (Шахов, 1993). Предполагается, что поглощенная антоцианами лучистая энергия используется для определенных типов регуляции метаболизма растений, в первую очередь, возможно, в процессах трансформации энергии в биологических мембранах (Шахов, 1993). Установлено противоположное изменение
всоотношении антоцианов и фотосинтетических пигментов к середине северного лета: при снижении содержания антоцианов в растениях увеличивается содержание хлорофилла и каротиноидов. Это может свидетельствовать об участии антоцианов в фотоэнергетике растительных клеток в качестве дополняющих к пластидным пигментам (Рузиева, 1987). Антоцианы в результате поглощения и преобразования энергии си- не-фиолетовых и зеленых лучей могут влиять на световой внутриклеточный режим и способствовать более производительному использованию солнечной энергии, например в условиях низких температур (Шахов, 1993).
Вобычных условиях биосинтез антоцианов и зеленых пигментов идет более или менее параллельно, о чем может свидетельствовать сходный характер накопления этих веществ
врастениях при воздействии светом на разных этапах их развития (Волынец, Прохорчик, 1983). Сведения о характере накопления антоциановых пигментов в условиях ингибирования биосинтеза фотосинтетических пигментов малочисленны. Тем
79
Глава 3
не менее имеются данные о влиянии полихроматического света различной интенсивности на накопление антоцианов в альбиносных тканях ячменя (Масленников, 2001; Масленников, 2003). Показано, что стимуляция накопления антоцианов нарастала с повышением интенсивности света и превосходила исходный уровень при максимальной интенсивности света в
25 Дж/м2 · с в 2,3 раза (рис. 3.6).
Содержание антоцианов, мг/г
Зеленые |
|
Альбиносные |
|
||
Полиномиальный |
|
Полиномиальный |
|
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1 |
|
|
|
|
|
|
0 |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
Дж/м2.с |
ИС |
25 |
Рис. 3.6. Влияние условий освещения на накопление антоцианов в листьях 20-дневных зеленых и альбиносных проростков ячменя, находящихся на воде (экспозиция — 48 часов)
Активация биосинтеза антоциановых пигментов в альбиносных листьях может быть также связана с процессами трансформации световой энергии и увеличением эффективности фотосинтетических процессов в условиях нестабильно функционирующего фотосинтетического аппарата за счет дополнительно поглощенной световой энергии антоцианами в тканях, имеющих следовое количество зеленых пигментов (Масленников, 2003).
80