Пищевая химия. Жирорастворимые витамины. Учебное пособие

бермана-Бухарда) с максимумом поглощения при 620 нм. В присутствии ацетилхлорида раствор витамина D дает с 1,3-дихлоргидрином глицерина зеленое окрашивание с максимумом поглощения при 625 нм. С фурфуролом в присутствии трихлоруксусной кислоты витамин D дает цветную реакцию, после нагревания развивается розово-фиолетовое окрашивание с максимумом поглощения при 500–550 нм.

С йодом в этилендихлориде в присутствии витаминов D2, D3 развивается интенсивное желтое окрашивание с максимумом поглощения при 450 нм. Интенсивность окрашивания повышается при добавлении п-хлорбензоата ртути. Реагент обладает высокой специфичностью по отношению к витамину D и более высокой чувствительностью, чем с 1,3-дихлоргидрином глицерина, но менее чем с треххлористой сурьмой. При этом провитамин D и холестерол не мешают определению.

Практическое значение имеет метод, в основе которого лежит цветная реакция с треххлористой сурьмой. Витамины D2, D3 образуют с треххлористой сурьмой в хлороформе окрашенное соединение оранжевого цвета с максимумом поглощения при 520 нм. Реакция не достаточно специфична, но широко используется для количественного анализа продуктов с D-витаминной активностью. Для повышения стабильности реагента добавляют свежеперегнанный ацилхлорид (2,5–3 %) или уксусный ангидрид. Эргостерол с треххлористой сурьмой дает красное окрашивание, а холестерол – желтое .

Ход анализа. Точную навеску анализируемого продукта (3–6 г) внести в коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 100 мл, добавить 10 мл 10 % раствора гидроксида калия и закрыть колбу обратным холодильником и поместить на час в водяную баню при температуре кипения спирта.

После омыления колбу с гидролизатом охладить, отсоединить холодильник и добавить 20 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы количественно перенести в делительную воронку, колбу триж-

41

ды ополоснуть небольшими порциями дистиллированной воды и смывы объединить с гидролизатом. Неомыляемую фракцию экстрагировать диэтиловым эфиром, используя на каждую экстракцию соответственно 50, 25, 25 мл эфира. Объединенные эфирные вытяжки перенести в делительную воронку и отмыть от щелочи дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой (1-2 капли концентрированной кислоты на 1 литр), до отрицательной реакции промывных вод на фенолфталеин. Общий объем дистиллированной воды, взятой для промывки эфирных вытяжек, не должен превышать 200 мл.

Органический слой (верхние) отделить, собрать в плоскодонную колбу и оставить над осушителем (5-7 г свежепрокаленный сульфат натрия) при периодическом перемешивании. Спустя 30 минут, после полного осветления раствора, осушитель отфильтровать в круглодонную колбу со шлифом через воронку Шотта. Дважды промыть осушитель на фильтре небольшими порциями диэтилового эфира (по 5 мл), и добавить их к основному эфирному раствору. Растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа при температуре 30 o С до сухого остатка.

Неомыляемый остаток растворить в сухом хлороформе и количественно перенести в мерную колбу с таким расчетом, чтобы полученный раствор содержал 100–1000 МЕ/мл (2,5–25 мкг/мл) витамина D. Объем раствора в мерной колбе довести до метки тем же растворителем. Отобрать из мерной колбы 1 мл раствора в фотоколориметрическую кювету, добавить 3 капли свежеперегнанного ацетилхлорида, 6 мл раствора хлорида сурьмы в хлороформе и выдержать ровно 4 мин после добавления последнего реактива. Измерить оптическую плотность анализируемой смеси на фотоколориметре при 500 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно контрольного раствора.

42

Контрольный раствор. Отмерить в фотоколориметрическую кювету 1 мл хлороформа, 6 мл раствора треххлористой сурьмы в хлороформе и 3 капли ацетилхлорида.

По калибровочному графику определить концентрацию витамина в пробе. Массовую долю витамина D (СD, млн-1) в анализируемой пробе рассчитать по формуле

где СК – концентрация витамина D, найденная по калибровочному графику, мкг/мл;

V1 – общий объем хлороформного раствора после экстракции, мл;

V2 – объем хлороформного раствора, взятый на проведение цветной реакции, 1 мл;

m – навеска исследуемого материала, г.

Построение калибровочного графика. Точную навеску кри-

сталлического кальциферола (2,5 мг) растворить в 15 мл хлороформа и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл (с таким расчетом, чтобы содержание витамина D составляло 103 МЕ/мл). Из стандартного раствора приготовить пять калибровочных растворов с массовой концентрацией кальциферола от 100 до 1000 МЕ/мл (2,5– 25 мкг/мл) по схеме, приведенной в табл. 11.

Таблица 11 – Схема приготовления калибровочных растворов кальциферола

43

Для этого в фотоколориметрическую кювету отмерить соответствующее количество стандартного раствора кальциферола, довести объем до 1 мл хлороформом, добавить 3 капли свежеперегнанного ацетилхлорида, 6 мл раствора хлорида сурьмы в хлороформе. Ровно через 4 мин после добавления последнего реактива измерить оптическую плотность калибровочных растворов при 500 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора треххлористой сурьмы в хлороформе. Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А500) – содержание витамина D (СD, мкг/мл).

Определение витамина D в молочном жире

Ход анализа. В коническую колбу внести 10 г молочного жира, 40 мл 96 % этилового спирта и 8 мл 50 % раствора гидроксида калия. Подсоединить к колбе обратный холодильник и поместить ее на водяную баню. Омыление вести в течение 40–50 мин при кипении растворителя в колбе. Полученный гидролизат охладить, отсоединить холодильник и провести экстракцию неомыляемой части с использованием диэтилового эфира по методике, описанной выше.

После удаления растворителя, сухой остаток растворить в 5 мл сухого хлороформа. Из полученного раствора отобрать 1 мл, добавить 6 мл раствора треххлористой сурьмы в хлороформе и 3 капли ацетилхлорида. Измерить оптическую плотность при 500 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. По величине оптической плотности с использованием калибровочного графика определить концентрацию витамина. Массовую долю витамина D (СD, млн-1) в анализируемой пробе рассчитать по формуле

CD = CK ×V , m

где СК – количество витамина D, найденное по калибровочному графику, мкг/мл;

V – объем хлороформного раствора неомыляемой части, 5 мл; m – навеска молочного жира, г.

44

Определение витамина D в смеси с другими витаминами

При определение витамина D в природных материалах необходимо предварительно очистить образец от соединений, мешающих определению: хроматографически удалить витамин А, каротины и осадить спиртовым раствором дигитонина стерины (см. выделение стеринов) в виде дигитонидов. При этом эргокальциферол и холекальциферол дигитонином не осаждаются.

Ход анализа. Точную навеску анализируемого продукта (5–10 г) внести в коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 100 мл, добавить 10 мл 10 % раствора гидроксида калия и подсоединить обратный холодильник. Провести омыление по вышеописанной методике.

Неомыляемый остаток растворить в минимальном объеме хлороформа, перенести количественно в мерную колбу вместимостью 50 мл и довести объем раствора до метки хлороформом. Отобрать острого определенный объем и определить содержание витамина А.

Другую часть (точно измеренную) хлороформного раствора использовать для хроматографирования на бентонитовой колонке. Поверх адсорбента поместить свежепрокаленный сульфат натрия слоем 10 мм. Адсорбент смочить хлороформом, оставив на поверхности слой около 0,5 см. Скорость прохождения анализируемого раствора через колонку не должна превышать 40–50 капель/мин. После прохождения анализируемого раствора через колонку адсорбент промыть тремя порциями хлороформа по 15 мл каждая, не допуская при этом смывания в приемник синего кольца, соответствующего витамину А.

Элюаты собрать в колбу и удалить растворитель на ротационном вакуумном испарителе в токе инертного газа. Полученный сухой остаток растворить в минимальном количестве абсолютного этилового спирта, подсоединить к колбе обратный холодильник и нагреть содержимое колбы на водяной бане, не допуская закипания раствора. К на-

45

гретому раствору добавить по каплям раствор дигитонина в 6–8 раз, превышающий требуемое количество по уравнению реакции.

Выпавший осадок дигитонида отфильтровать. Фильтрат перенести в делительную воронку и вдвое разбавить дистиллированной водой Неомыляемую часть экстрагировать диэтиловым эфиром. Дальнейший анализ вести по методике описанной выше. Попутно с определение витаминов А и D можно определить содержание стеринов весовым методом. (см. Определение стеринов весовым методом).

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

10 % и 50 % растворы гидроксида калия, диэтиловый эфир, абсолютный хлороформ, концентрированная соляная кислота, индикатор – раствор фенолфталеина, осушитель – безводный сульфат натрия, свежеперегнанный ацетилхлорид, 21–23 % раствор хлорида сурьмы (III) в хлороформе, стандартный раствор кальциферола (1000 МЕ/мл витамина D), 96 % этиловый спирт, абсолютный этиловый спирт, 1 % спиртовый раствор дигитонина, бентонит;

пипетки; конические колбы с пришлифованными пробками вместимостью 100 мл, круглодонные колбы с пришлифованными пробками вместимостью 100 мл, обратные холодильники, делительные воронки, воронки Шотта, мерная колба вместимостью 100 мл, пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм, бентонитовая колонка (высотой 20–25 см и диаметром 1,5 см);

аналитические весы, ротационный вакуумный испаритель, фотоколориметр (λ=500 нм), водяная баня,

Приготовление адсорбента. Бентонит залить 2 н раствором соляной кислоты (1 л 2 н раствора соляной кислоты на 40 г бентонита), довести полученную суспензию до кипения, охладить и отфильтровать. Осадок бентонита промыть дистиллированной водой до полного удаления хлора. Промытый бентонит высушить при 120–130 оС и растереть в ступке. Хранить адсорбент в склянке с притертой пробкой.

46

Контрольные вопросы

1.Объясните особенности в нумерации атомов в молекуле кальциферола? Какую конфигурацию имеет диеновый фрагмент, соединяющий циклогексановые кольца, в витамине D? Как это влияет на витаминную активность?

2.Сколько форм витамина D известно и чем они различаются? Какие из них имеют природное происхождение, а какие синтетическое? Назовите основные природные источники витамина D2 и D3? Что представляет собой витамин D1?

3.Может ли синтезироваться витамин D3 в организме человека? Приведите условия синтеза витамина D3 и его транс-изомера. Назовите области применения транс-изомера витамина D3. Какова его витаминная активность? Напишите уравнение реакции холекальциферола с йодом.

4.Как получают витамины D4–D 7? Какова их витаминная активность? Назовите основные предшественники витамины D4–D 7.

5.Приведите биологически активную форму витамина D? Какое влияние оказывает гидроксилирование витамина D на проницаемость кальция через биомембраны в организме человека?

6.Какова роль витамина D и какие процессы в организме человека он регулирует? В каких единицах измеряют витаминную активность веществ с D–витаминной активностью?

7.Назовите пищевые источники витамина D. Почему литературные данные о содержании витамина в продуктах питания противоречивы?

8.Назовите суточную потребность в витамине D. Какие симптомы дефицита витамина и к каким заболеваниям он может привести? В чем опасность избыточного поступления витамина в организм?

9.Какие продукты массового потребления витаминизируют для профилактики D-гиповитаминоза? Насколько стабилен витамин D в

47

процессе кулинарной обработки? Приведите способы промышленного получения витамина D?

10. Объясните, почему витамин D дает с хлоридом сурьмы оранже- во-розовое окрашивание, а витамин А – синее. Как влияет на цвет, образующихся комплексов, длина диеновой цепи?

48

1.3 ВИТАМИН Е

Витамин Е (токоферолы). Эта группа жирорастворимых природных соединений, синтезируемых злаковыми и масличными культурами. Витамин Е впервые был выделен в 1922 г. Г.Эвансоном и К.Бишоп из масла проростков пшеницы, как жирорастворимый фактор, необходимый для размножения крыс. В чистом виде α-, β-токоферолы были получены в 1936 г., а в1938 г. Э.Фернгольц установил химическую структуру α-токоферола.

По химическому строению токоферолы относят к природным производным хромана (бензо-γ-дигидропирана), которые содержат боковую фитильную цепь из шестнадцати углеродных атомов. Токоферолы (α-, β-, γ-, δ-) различают между собой по количеству и расположению метильных групп в бензольном фрагменте. В связи с тем, что α- токоферол сосредоточен в основном в хлоропластах, то им богаты в первую очередь зеленые части растений.

Токоферолы имеют три асимметрических атома углерода, один из них в цикле (С2) и два других в боковой цепи (С4′, С8′), что опреде-

49

ляет возможность существования восьми оптических изомеров и четырех рацематов для каждого токоферола.

Позднее были выделены витамеры с одним асимметрическим атомом при С2 и ненасыщенной боковой цепью (изопреноидной), которые получили название токотриенолы (соответственно α-, β-, γ-, δ-).

13

О2

Ибыли обнаружены два α-токоферола с мононенасыщенной боковой цепью: α-токомоноенол из пальмового масла и морской токоферол из икры кеты.

Таким образом, в настоящее время известно десять природных аналогов витамина Е.

Растительных источников токотриенолов не много. Они содержатся в зернах таких культур как рис, ячмень, рожь, пшеница, особенно богат токотриенолами зародыш. В отличие от токоферолов, которые

50