Пищевая химия. Жирорастворимые витамины. Учебное пособие

порциями дистиллированной воды (общий объем 50 мл). Смывы объединить с основным гидролизатом и собрать в делительной воронке. Из полученного гидролизата трижды экстрагировать неомыляемую фракцию диэтиловым эфиром, используя на каждую экстракцию по 50 мл эфира. Эфирные вытяжки объединить и отмыть от щелочи дистиллированной водой до отрицательной реакции промывных вод по фенолфталеину. Объем дистиллированной воды не должен превышать 500 мл.

Органический слой (верхний) отделить, собрать в плоскодонную колбу и добавить осушитель (20 г безводного сульфата натрия). Спустя 30 мин осушитель отфильтровать в круглодонную колбу со шлифом через воронку Шотта. Дважды промыть осушитель на фильтре небольшими порциями диэтилового эфира (по 10 мл). Растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа при температуре не выше 40 оС, полученный неомыляемый остаток, растворить в 10 мл безводного хлороформа, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 25 мл и довести объем до метки хлороформом. Концентрация витамина А должна составить примерно

3мкг/мл.

Вколориметрическую кювету внести 0,4 мл полученного раствора, добавить 1–3 капли уксусного ангидрида, 4 мл насыщенного раствора треххлористой сурьмы в хлороформе и перемешать. Не позднее чем через 10 с измерить оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при 620 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора хлороформа. Массовую долю витамина А (СА, млн-1) рассчитать по формуле

где СК – концентрация витамина А, найденная по калибровочному графику, МЕ/мл;

V1 – объем раствора неомыляемой части в хлороформе, 25 мл;

21

m – навеска исследуемого препарата, г; 0,303 – коэффициент пересчета МЕ в млн-1.

Построение калибровочного графика. Точную навеску кристал-

лического ретинолацетата, содержащего не менее 105 МЕ/мл, растворить в хлороформе (в мерной посуде) с таким расчетом, чтобы содержание ретинолацетата составило около 100 МЕ/мл. Из стандартного раствора приготовить пять калибровочных растворов с массовой концентрацией ретинолацетата 2–10 МЕ/0,4 мл (табл. 7).

Таблица 7 – Схема приготовления калибровочных растворов ретинолацетата

Для этого в градуированные пробирки отмерить необходимое количество стандартного раствора ретинолацетата и довести объем калибровочных растворов до 10 мл хлороформом. В кювету для колориметрирования отобрать пипеткой по 0,4 мл каждого калибровочного раствора, добавить 1–3 капли уксусного ангидрида, 4 мл насыщенного раствора треххлористой сурьмы в хлороформе и не позднее чем, через 10 с измерить оптическую плотность при длине волны 620 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А620) – содержание ретинол ацетата (СА, МЕ/мл).

22

Определение витамина А по реакции с 1,3-дихлор-2-пропанолом

Метод основан на реакции витамина А с соляной кислотой в среде 1,3-дихлор-2-пропанола (гидриновый реактив). Образующееся при этом соединение имеет фиолетовую или фиолетово-пурпурную окраску. Максимум поглощения лежит при 550 нм. При взаимодействии витамина А с 1,3-дихлор-2-пропанолом образуется более стабильное соединение, чем с хлоридом сурьмы, сохраняющее окраску постоянной в течение 2-10 мин. Однако, чувствительность данного метода ниже, а интенсивность окраски образующегося продукта реакции в пять раз слабее, чем при использовании метода Карра-Прайса (с треххлористой сурьмой).

Ход анализа. Подготовка пробы к анализу аналогична методу Карра-Прайса. Для омыления 5 г анализируемого продукта внести 10 мл 20 % спиртового раствора гидроксида калия. Неомыляемые вещества экстрагировать диэтиловым эфиром, после удаления эфира полученный остаток растворить в необходимом количестве хлороформа.

В кювету для колориметрирования отмерить пипеткой 1 мл полученного раствора неомыляемого остатка, добавить 2 мл гидринового реактива и спустя 5 мин колориметрировать при длине волны 550 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм относительно рабочего раствора сравнения витамина А (рабочий раствор приготовить из стандартного раствора сравнения). Рассчитать массовую долю витамина А (СА, млн-1) по формуле

гдеε – экстникция исследуемого раствора ; εС – экстникция рабочего раствора сравнения;

V1 – объем неомыляемого остатка в хлороформе, мл;

23

0,03 – содержание витамина А в стандартном растворе, 0,03 мг/мл; V2 – общий объем раствора, взятый для колориметрирования, мл; m – масса навески исследуемого материала, г;

1000 – коэффициент пересчета в млн-1.

Экстракция витамина А из пищевых продуктов

Провести омыление жира рыб или млекопитающих (навеска – 0,5-1 г) с добавлением 10 мл 0,5 н спиртового раствора гидроксида калия. Далее как описано в методике выше.

Провести омыление сливочного или топленого масел (навеска –

10–20 г) с использованием 20–40 мл 20 % спиртового раствора гидроксида калия в течение 1–2 ч при температуре 85–90 оС. К охлажденному раствору добавить 20–40 мл дистиллированной воды и экстрагировать диэтиловым эфиром. На первую экстракцию использовать 75 мл экстрагента, две последующие по 25 мл. Далее по методике.

Молоко в количестве 100-200 мл смешать 10–20 мл 60 % раствора гидрокисида калия, добавить 20–40 мл этилового спирта и оставить на 48 ч в темном месте при 20–25 оС при небольшом перемешивании. Неомыляемую часть экстрагировать диэтиловым эфиром в четыре приема. На первую экстракцию использовать 75 мл экстарагента, две последующие по 25 мл. Далее по методике.

Печень. Гомогенизированную навеску печени (около 1 г) залить 1 мл 60 % раствора гидроксида калия и 10–20 мл этилового эфира. Гидролиз вести в течение 2–4 ч при температуре 85–90 0С. Далее по методике.

Яичный желток. К 20 г яичного желтка добавить 6 мл 60 % раствора гидроксида калия и 10–20 мл этилового спирта. Время гидролиза 2 ч при температуре 85–90 оС. Далее по методике.

Витаминизированные кондитерские изделия. Кондитерские из-

делия (конфеты, пряники) экстрагировать путем настаивания. Для этого 20–50 г исследуемого продукта трижды экстрагировать диэтиловым эфиром, затрачивая на каждую экстракцию по 20 мл. Объединенные

24

эфирные вытяжки отфильтровать, растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа. Полученный остаток растворить в хлороформе. Далее по методике.

Определение витамина А совместно с каротином. Эфирный экс-

тракт осушить и отогнать растворитель в атмосфере инертного газа. Остаток неомыляемых липидов обрабатывают по-разному. Для определения витамина А остаток после удаления диэтилового эфира растворить в хлороформе, для определения каротина – в петролейном эфире.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

20, 50 % раствор гидроксида калия, этиловый спирт (ректификат), аскорбиновая кислота, диэтиловый эфир, абсолютный хлороформ, индикатор – раствор фенолфталеина, осушитель – безводный сульфат натрия, уксусный ангидрид, раствор хлорида сурьмы (III) в хлороформе), 1,3-дихлор-2-пропаноле (гидриновый реактив), стандартный раствор витамина А (ацетат или пальмитат), стандартный и рабочий растворы сравнения витамина А (метилового фиолетового и сафронина);

пипетки; колбы с пришлифованными пробками вместимостью 250 мл, плоскодонные колбы, обратные холодильники, водяная баня (80 оС), делительные воронки, воронки Шотта, мерная колба вместимостью 100 мл, пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм;

аналитические весы; водяная баня, ротационный вакуумный испаритель, фотоколориметр (λ 620, 550 нм).

Раствор хлорида сурьмы (SbCl3). Хлорид сурьмы на фильтре промыть хлороформом до тех пор, пока стекающий раствор не станет бесцветным. Промытый реактив высушить в эксикаторе, используя в качестве осушителя концентрированную серную кислоту, в течение су-

25

ток. Из осушенного реактива приготовить насыщенный раствор в хлороформе.

Раствор хлорида сурьмы (реактив Кара-Прайса). В конической колбе с пришлифованной пробкой вместимостью 500 мл растворить в хлороформе при нагревании на водяной бане (40 оС) 60 г хлорида сурьмы. После растворения осадка раствор охладить до комнатной температуры, внести 6–9 мл уксусного ангидрида. Колбу с раствором хлорида сурьмы закрыть пробкой и оставить в темном месте на 14–18 ч для отстаивания. Полученный прозрачный раствор аккуратно слить в склянку из темного стекла. Срок хранения раствора не более 40 дней при комнатной температуре.

Гидриновый реактив (соляная кислота в 1,3-дихлор-2-пропаноле).

Смешать 2 мл концентрированной соляной кислоты с 98 мл 1,3-дихлор- 2-пропанола, перемешать и перенести в склянку из темного стекла. Хранить в холодильнике.

Стандартный раствор сравнения. В мерную колбу вместимо-

стью 1 л внести 10 мг метилового фиолетового и 2,3 мг сафронина и довести объем до метки дистиллированной водой.

Рабочий раствор сравнения (эталонный раствор). К 12 мл стандартного раствора сравнения добавить 13 мл дистиллированной воды и перемешать. Величина экстинкции 1 мл рабочего раствора сравнения соответствует 0,03 мг витамина А.

Определение витамина А методом ТСХ

В колбу для омыления взвесить на аналитических весах навеску измельченного анализируемого продукта (печени) 0,05–0,10 г и, добавить 20 мл этанола, 100 мг пирогаллола или гидрохинона и 5 мл 60 % раствора гидроксида калия. Подсоединить к колбе обратный холодильник. Омыление вести на глицериновой бане при 90 оС в течение 30 мин.

26

После охлаждения до комнатной температуры перелить щелочной гидролизат в делительную воронку и провести трехкратную экстракцию гексаном (каждая порция экстрагента по 30 мл). Объединенные экстракты промыть дистиллированной водой до нейтральной реакции (по универсальной индикаторной бумаге) и отфильтровать через безводный сульфат магния в круглодонную колбу со шлифом. Осадок промыть на фильтре небольшими порциями гексана. Из полученного фильтрата удалить растворитель на ротационном вакуумном испарителе в инертной атмосфере, образовавшийся остаток растворить в хлороформе.

На стартовую линию пластины «Silufol» нанести 0,1 мл хлороформного раствора неомыляемого остатка. Рядом на линию старта пластины нанести каплю свидетеля – стандартного раствора ретинолацетата (0,5 мкг.). Поместить пластины в хроматографическую камеру. В качестве подвижной фазы использовать смесь хлороформ – гептан (94:6).

После достижения фронтом растворителя верхнего края, пластину извлечь ее из камеры, подсушить и «проявить», путем опрыскивания 0,2 % раствором хлорного железа. Высушенную пластину поместить в камеру насыщенную парами йода. Витамин А проявляется в виде про темно-синей полосы на голубовато коричневом фоне. Пластину снова подсушить теплым воздухом до ее полного обесцвечивания (исчезновения следов йода). После этого пластину обработать 0,5 % спиртовым раствором 2, 2′-дипиридила, в результате чего на белом фоне пластины появиться розово-красная полоса, соответствующая витамину А. Определить величину Rf пробы со свидетелем (стандартом).

Закрепить окраску образующегося комплекса на пластине, обработав парами аммиака. Окрашенную зону пластины вырезать ножницами и перенести в пробирку с притертой пробкой. В пробирку добавить элюент – смесь этанола, соляной кислоты, фосфорной кислоты и дистиллированной воды в объемных соотношениях 6:3:1:2. Окрашенный раствор элюата отфильтровать через бумажный фильтр.

27

Измерить оптическую плотность раствора при длине волны 490 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения (элюент). Содержание витамина определить по калибровочному графику.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

96 % этиловый спирт, пирогаллол (или гидрохинон), 60 % раствор гидроксида кали, гексан, индикаторная бумага, безводный сульфат магния, пластины «Silufol» , хлороформ, стандартный раствор ацетата ретинола, гептан, 0,2 % раствор хлорного железа, кристаллический йод, элюент (смесь этанола, соляной кислоты, фосфорной кислоты и дистиллированной воды в объемных соотношениях 6:3:1:2), 25 % раствор аммиака, 0,5 % спиртовый раствор 2, 2’- дипиридила;

пипетки; колбы круглодонные с пришлифованными пробками, плоскодонные колбы, обратные холодильники, делительные воронки, воронки Шотта, мерные колбы, пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм;

аналитические весы; ротационный вакуумный испаритель, фотоэлектроколориметр, хроматографическая камера, глицериновая баня.

Контрольные вопросы

1.Назовите структурные особенности витамина А и три его основные формы. Какая из них природная? Как она метаболически связана с другими формами витамина А?

2.Сколько стереоизомерных форм возможно для витамин А? Какие из них наиболее известные и какова их витаминная активность?

3.В чем различия в строении и биологической активности витаминов А1 и А2. Назовите природные источники витамина А2? Какая конфигурация кратных связей в природном витамине А2?

4.Объясните биологическую роль ретиноевой кислоты? Каков ее метаболизм в организме человека?

28

5.Какое заболевание вызывает недостаток витамина А в организме человека? Какова в этом биохимическая роль ретиналя? Какой вид изомерии претерпевает ретиналь в составе зрительного пигмента родопсина?

6.Назовите пищевые источники витамина А? Присутствует ли витамин А в продуктах питания растительного происхождения?

7.Какова витаминная активность каротинов? И как влияет цистранс изомеризация на их витаминную активность?

8.Опишите терапевтический эффект витамина А. Какова его суточная потребность? Какую опасность представляет применение высоких доз витамина А? В каких единицах измеряют витаминную активность витамина А и его провитаминов?

9.Назовите промышленные способы получения витамина А. Для витаминизации каких продуктов питания его используют? Какова стабильность витамина А?

10.Приведите методы количественного определения витамина А в чистых препаратах? В чем сложность определения витамина А в продуктах питания?

11.В чем сущность спектрофотометрического метод количественного определения витамина А с использованием хлорида сурьмы? Можно ли реакцию хлорида сурьмы с витамином А проводить во влажной посуде? С какой целью в реакционную смесь вносят уксусный ангидрид?

29

1.2 ВИТАМИН D

Витамин D (кальциферол – несущий кальций) представляет собой группу витаминов, обладающих антирахитическим действием. Поиск антирахитического фактора проводился, начиная с конца 18 века. Однако оказалось, что витамин встречается во многих формах, поэтому открытие его, выделение отдельных форм и установление структуры происходило с начала 30-х до конца 50-х годов 20 века.

Кальциферолы можно рассматривать, как производные стеринов, вследствие этого углеродный скелет циклической части молекулы имеет следующую своеобразную нумерацию атомов:

В составе кальциферолов присутствует два циклогексановых кольца, связанных между собой этиленовым мостиком с двумя экзоциклическими двойными связями (=СН– СН=) с вытянутой S-транс- диеновой конфигурацией, а не стерически затрудненной S-цис-диеновой, и циклопентановое кольцо, которое содержит при С17 боковую алифатическую цепь. В положении С3 циклогексанового кольца располагается гидроксильная группа, а у С10 – метиленовая, входящая в систему трех сопряженных кратных связей. По расположению С5– С6 – двойной связи

30