Пищевая химия. Жирорастворимые витамины. Учебное пособие

рола количественно окисляется до токоферилхинона с раскрытием пиранового цикла.

α−токоферол γ−оксиалкилхинон

В качестве окислителя применяют азотную кислоту, нитрат серебра, хлорид железа (III), сульфат церия (IV).

Лабораторная работа 4. Колориметричекие методы определения

витамина Е

В основе определения токоферолов с использованием в качестве окислителя хлорида железа (III) лежит измерение интенсивности окраски комплекса восстановленного токоферолом хлорида железа (II) и 2, 2′-дипиридила в кислой среде (рН 1–2). Последний образует с ионами железа (II) устойчивый комплекс красно-рубиновго цвета.

окрашенный комплекс (красно-рубиновый)

Определение витамина Е в пищевых продуктах с использованием колориметрических методов осложнено не высокой специфичностью метода. Многие вещества, содержащиеся в исследуемых объектах, при окислении способны, подобно α-токоферолу, давать окрашенные продукты с аналогичным аналитическим сигналом. С целью повышения селективности определения, посторонние вещества (каротиноиды, стеролы, витамин А) удаляют, применяя щелочное омыление спирто-

61

вым раствором гидроксида калия с добавлением антиоксидантов (пирогаллола, аскорбиновой кислоты), с последующей экстракцией токоферола из неомыленной части диэтиловым эфиром.

Для определения токоферолов в продуктах питания и продуктах, обогащенных витамином Е, используют стандартизированный метод (ГОСТ 30627.3-98 – « Продукты молочные для детского питания»), для которого обязательной стадией является предварительное выделение жировой фракции путем экстракции. Применяют и другие способы выделения, а также прямое омыление навески.

Ход анализа. Анализируемую пробу (жидкую или пастообразную) выдержать при температуре 37 оС в течение 20–30 мин для равномерного распределения жировой фракции. На аналитических весах в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 100 мл взвесить навеску (около 15 г) жидкого или пастообразного продукта и растворить в 10 мл дистиллированной воды. При анализе сухих продуктов массу навески выбрать в зависимости от количества содержащегося витамина (табл.

19).

Таблица 19 – Зависимость массы навески жиросодержащего продукта от массовой доли витамина Е

К анализируемой пробе добавить аскорбиновой кислоты (0,1– 0,15 г), прилить 40 мл этилового спирта, перемешать и внести 5-7 мл 9 н раствора гидроксида калия. Соединить колбу с обратным холодильником и выдержать на кипящей водяной бане в течение 30 мин. По окончании гидролиза анализируемую пробу охладить до комнатной температуры и отсоединить холодильник.

62

Содержимое колбы количественно перенести в делительную воронку. Колбу трижды ополоснуть дистиллированной водой (общий объем воды 50 мл), а полученные смывы собрать в делительную воронку. Признаком полноты гидролиза является отсутствие помутнения гидролизата при добавлении воды. В случае образования мути гидролиз повторить, увеличив объем щелочи.

Кгидролизату добавить 25 мл эфира, закрыть воронку пробкой

иэнергично встрянуть несколько раз. Дождаться разделения водного и органического слоев, отделить органический слой (верхний). Экстракцию неомыляемых веществ повторить дважды, добавляя каждый раз новую порцию диэтилового эфира по 25 мл.

Эфирные вытяжки объединить, перенести в делительную воронку и трижды промыть дистиллированной водой до нейтральной реакции промывной жидкости по фенолфталеину (общий объем воды 50 мл). В сухую, предварительно взвешенную круглодонную колбу отфильтровать эфирные вытяжки на воронке Шотта через слой безводного сернокислого натрия (20-30 г). Осадок на фильтре промыть трижды диэтиловым эфиром (общий объем эфира не более 15 мл).

Колбу с объединенным эфирным фильтратом подсоединить к ротационному вакуумному испарителю и отогнать растворитель в атмосфере инертного газа на водяной бане при температуре не выше 30 оС. Неомыляемый остаток растворить в 15 мл абсолютного этилового спирта.

На анализ отобрать 1–5 мл спиртового раствора неомыляемого остатка (в зависимости от содержания токоферола) довести объем раствора до 5 мл абсолютным этиловым спиртом. К спиртовому раствору

прилить 0,5 мл 0,5 % спиртового раствора 2, 2′-дипиридила, 0,5 мл 0,025 % спиртового раствора хлорида железа (III), перемешать. Не ранее чем через 20 с добавить 0,5 мл 0,03 М спиртового раствора орто-

63

фосфорной кислоты и вновь перемешать. Параллельно провести холостой опыт на реактивы.

Для приготовления холостого опыта к 5 мл абсолютного этилового спирта прилить 0,5 мл 0,5 % спиртового раствора 2, 2′-дипиридила, 0,5 мл 0,025 % спиртового раствора хлорид железа (III), не более чем через 20 с добавить 0,5 мл 0,03 М спиртового раствора ортофосфорной кислоты.

Измерить оптическую плотность анализируемой и холостой проб на фотоэлектроколориметре при длине волны 490 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно абсолютного этилового спирта. Массовую долю α-токоферола (Сα-ТФ, млн-1) вычислить по формуле

Cα −ТФ = mК× ×V , m V1

где mК – масса α-токоферола в анализируемой пробе, установленная по калибровочному графику (по разнице значений оптических плотностей между опытной и холостой пробами относительно абсолютного этилового спирта), мкг;

m – масса продукта, взятая на гидролиз, г;

V – общий объем раствора неомыляемого остатка в абсолютном этиловом спирте, 15 мл;

V1 – объем спиртового раствора, взятого на цветную реакцию, 1–5 мл.

Гидролиз стандартного раствора α-токферола. В круглодон-

ную колбу вместимостью 100 мл отмерить пипеткой 5 мл стандартного раствора α-токоферола (0,4 мг/мл), добавить 15 мл этилового спирта, 0,1 г аскорбиновой кислоты и 1 мл 9 н раствора гидроксида калия. Колбу соединить с обратным холодильником и выдержать в кипящей водяной бане 20 мин.

По окончании гидролиза колбу охладить, отсоединить холодильник и количественно перенести полученный гидролизат в дели-

64

тельную воронку. Колбу трижды ополоснуть дистиллированной водой (общий объем воды 50 мл), а полученные смывы собрать в делительную воронку. Дальнейшую экстракцию неомыляемых веществ вести по методике описанной выше для анализируемой пробы.

Колбу с эфирным экстрактом неомыляемых веществ подсоединить к ротационному вакуумному испарителю и отогнать растворитель в атмосфере инертного газа на водяной бане при температуре не выше 30 оС. Неомыляемый остаток растворить 15 мл абсолютного этилового спирта, количественно перенести раствор в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем раствора до метки тем же растворителем. Концентрация стандартного раствора a-токоферола после гидролиза должна составлять не менее 20 мкг/мл.

Проверка концентрации стандартного раствора α-токоферола.

Измерить оптическую плотность стандартного спиртового раствора a- токоферола на спектрофотометре при длине волны 292 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно абсолютного спирта. Рассчитать массовую концентрацию (ССТ, мкг/мл) стандартного раствора a-токоферола по формуле

где А – оптическая плотность стандартного раствора a-токоферола относительно абсолютного этилового спирта; Е11см% – удельный показатель поглощения при длине волны 292 нм для 1 %

раствора a-токоферола в абсолютном этиловом спирте, 75 мл/мкг×см; 104 – концентрация a-токоферола 1 % раствора a-токоферола, мкг/мл; l – длина оптического пути, 1 см.

Построение калибровочного графика. Из рабочего раствора a-

токоферола (20 мкг/мл) в градуированных пробирках приготовить пять

65

калибровочных растворов по схеме (табл. 20) и довести объем растворов до 5 мл абсолютным этиловым спиртом.

Таблица 20 – Схема приготовления калибровочных растворов α-токоферола

В шестой пробирке приготовить холостой опыт, для этого отмерить пипеткой 5 мл абсолютного этилового спирта. Во все шесть пробирок прилить по 0,5 мл 0,5 % спиртового раствора 2, 2′-дипиридила, 0,5 мл 0,025 % спиртового раствора хлорид железа (III) и перемешать. Не более чем через 20 с добавить 0,5 мл 0,03 М спиртового раствора ортофосфорной кислоты и вновь перемешать полученные растворы.

Измерить оптическую плотность калибровочных растворов и холостой пробы на фотоколориметре при длине волны 490 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно абсолютного этилового спирта. Построить калибровочный график в координатах: разность показаний оптической плотности калибровочных растворов и холостого опыта (А490) – содержание α-токоферола (Сα-ТФ , мкг/мл).

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

диэтиловый эфир, абсолютный этиловый спирт, 0,2 % и 0,025 % спиртовый раствор хлорида железа (FeCl3 ·6H2O), натрий сернокислый без-

водный, аскорбиновая кислота, 0,5 % спиртовый раствор 2, 2′- дипиридила (С10Н8N2), 0,03 М спиртовый раствор ортофосфорной кислоты (Н3РО4), 9 н раствор гидроксида калия, 1 % спиртовый раствор фенолфталеина, 100 % препарат α-токоферол ацетата или 30 % масляный раствор;

66

колбы с пришлифованными пробками вместимостью 250 мл, обратные холодильники, делительные воронки, воронки Шотта, мерные колбы вместимостью 100 мл, пипетки, градуированные пробирки;

аналитические весы, фотоэлектроколориметр (λ=490 нм, кюветы с длиной оптического пути 10 мм), спектрофотометр (λ=292 нм), ротационный вакуумный испаритель, водяная баня.

Стандартный раствор α-токоферола (0,4 мг/мл). Точную на-

веску 0,04 г препарата α-токоферол ацетата или 30 % масляный раствор α-токоферол ацетата растворить 20 мл абсолютного этилового спирта, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем раствора до метки тем же растворителем.

Рабочий раствор α-токоферола (20 мкг/мл). В мерную колбу вместимостью 50 мл отмерить 2,5 мл стандартного раствора α- токоферола (0,4 мг/мл) и довести объем раствора до метки абсолютным этиловым спиртом.

0,2 % спиртовый раствор хлорида железа. Точную навеску 0,2 г

треххлористого железа (FeCl3 ·6H2O) растворить в 25 мл абсолютного этилового спирта, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем раствора тем же растворителем до метки. Хранить раствор в темной склянке в холодильнике.

0,025 % спиртовый раствор хлорида железа. К 1,25 мл 0,2 %

спиртового раствора треххлористого железа добавить 8,75 мл абсолютного этилового спирта и перемешать.

0,03 М спиртовый раствор ортофосфорной кислоты. Точную навеску 0,327 г ортофосфорной кислоты растворить в 25 мл абсолютного этилового спирта, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем раствора тем же растворителем до метки.

0,5 % спиртовый раствор 2,2′-дипиридила. Точную навеску 0,5

г 2, 2′-дипиридила (С10Н8N2) растворить в 25 мл абсолютного этилового

67

спирта, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем раствора тем же растворителем до метки.

Лабораторная работа 5. Титриметрический метод определения α-

токоферол ацетата в масляных растворах

Количественное определение α-токоферола ацетата основано на предварительном превращении его в α-токоферол и окислении последнего сульфатом церия в среде абсолютного этилового спирта, который устойчив к действию этого окислителя. Поскольку токоферол ацетат практически нерастворим в воде и трудно гидролизуется и в кислой и щелочной средах, то его гидролиз осуществляют по реакции переэтерификации с этиловым спиртом в присутствии концентрированной серной кислоты.

Образовавшийся α-токоферол титруют водным 0,01М раствором сульфата церия с индикатором дифениламином до появления синефиолетового окрашивания. Сульфат церия (IV) окисляет α-токоферол до п-токоферилхинона:

В точке эквивалентности дифениламин окисляется сульфатом церия с образованием продукта окисления сине-фиолетового цвета.

68

C= 2,364 ×V ×V1 ×100 ,

Еm ×V2

где V – разность объемов пошедших на титрование опыта и контроля 0,01 М раствора сульфата церия, мл; 2,364 – титр 0,01М раствора сульфата церия, мг/мл.

m – масса анализируемой пробы, взятой на гидролиз, г; V1 – общий объем гидролизата, 50 мл;

V2 – объем гидролизата, взятого титрование, 10 мл; 100 – коэффициент пересчета в мг%.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

абсолютный этиловый спирт, концентрированная и 85 % серная кислота, 0,5% раствор дифениламина, 0,01М раствором сульфата церия;

колбы для титрования, колбы с пришлифованными пробками вместимостью 100 мл, обратные холодильники, мерные колбы вместимостью 50 мл, пипетки, бюретки;

аналитические весы, водяная баня.

Лабораторная работа 6. Метод раздельного определения a-

токоферола и суммы других форм токоферола

Для одновременной оценки Е-витаминной активности и антиоксидантной способности используют химический метод, позволяющий провести раздельный количественный анализ α-токоферола и суммы β-, γ-, δ-токоферолов. В основе метода лежит способность смеси β-, γ-, δ-токоферолов и другие форм токоферола образовывать с солями азотистой кислоты окрашенные нитрозопроизводные желтого цвета. В отличие от которых, α-токоферол в реакцию нитрозирования не вступает. Метод используют для определения Е-витаминной активности расти-

70