Пищевая микробиология. Лабораторный практикум

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

К а ф е д р а «Технология пищевых производств и биотехнология»

Е.Ю. РУДЕНКО

ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Лабораторный практикум

Самара Самарский государственный технический университет

2019

1

Печатается по решению ученого совета СамГТУ (протокол № 9 от 27.04.2018 г.).

УДК 579.67:664 (076.5)

ББК 28.4:36я73 Р 83

Руденко Е.Ю.

Р 83 Пищевая микробиология: лабор. практ. / Е.Ю. Руденко. – 2-е изд. – Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2019. – 52 с.

Рассмотрены методы микробиологического анализа воды, воздуха, пивоваренного производства, кондитерских изделий, маргарина и майонеза.

Лабораторный практикум предназначен для студентов, обучающихся по направлению подготовки 19.03.02 «Продукты питания из растительного сырья»; он может быть интересен для преподавателей, специалистов пищевой промышленности, научных работников и аспирантов.

УДК 579.67:664 (076.5) ББК 28.4:36я73 Р 83

Р е ц е н з е н т канд. хим. наук, доцент Г.С. Муковнина

© Е.Ю. Руденко, 2019 © Самарский государственный

технический университет, 2019

2

ВВЕДЕНИЕ

В лабораторном практикуме рассмотрены методы микробиологического анализа воды, воздуха, пивоваренного производства, кондитерских изделий, маргарина и майонеза.

Лабораторный практикум предназначен для студентов факультета «Пищевых производств», обучающихся по направлению 19.03.02 «Продукты питания из растительного сырья», и выполнен в соответствии с требованиями образовательного стандарта для данного направления.

Практикум включает пять лабораторных работ по основным разделам курса «Пищевая микробиология». Каждая лабораторная работа содержит краткие теоретические сведения, экспериментальную часть и контрольные вопросы.

3

Лабораторная работа № 1 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОДЫ

Микробиота воды отражает содержание микроорганизмов в почве около водоема, она постоянно меняется и обновляется. Это обусловлено попаданием различных бактерий с талыми, ливневыми и сточными водами, с пылью, из гниющих растений и организмов живущих в водоеме рыб. Микробиота в пресных и соленых водоемах различна: в морях и океанах она очень разнообразна и представлена в основном галофильными микроорганизмами. Вода артезианских скважин вследствие фильтрующей способности почвы почти не содержит микроорганизмов. В пресных водоемах обнаруживаются кокки (Micrococcus roseus и др.) и палочковидные бактерии (Pseudomonas fluorescens). В воде мало анаэробов, так как они в основном обитают в иле на дне водоемов.

С талыми, ливневыми и сточными водами в реки и озера попадают микроорганизмы нормальной биоты кишечника человека и животных, например, кишечная палочка, энтерококки и клостридии, а иногда и патогенные микроорганизмы (например, возбудители дизентерии – бактерии рода Shigella, холерные вибрионы – Vibrio cholerae, вирусы гепатита, полиомиелита и др.). В водоемах они сохраняются жизнеспособность от нескольких дней до нескольких недель.

Вода, используемая в пищевых производствах, должна соответствовать санитарным нормам. Для контроля степени загрязнения воды регулярно проводят ее микробиологический анализ. Водопроводную воду исследуют не реже одного раза в месяц, артезианскую – не реже одного раза в год, воду открытых водоемов и колодцев – ежедневно [2].

Отбор, хранение и транспортирование проб воды

Для микробиологического исследования воду отбирают с соблюдением правил асептики в емкости, изготовленные из материалов, не нарушающих жизнедеятельность микроорганизмов.

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или стеклянные емкости много-

4

кратного применения вместимостью не менее 500 см3, оснащенные плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги или плотной бумаги).

Пробу отбирают в подготовленную посуду. Посуду предварительно стерилизуют, закрыв ее ватно-марлевой пробкой, покрытой сверху бумажным колпачком. К горлышку посуды привязывают бумажный пакетик с завернутой в него каучуковой или резиновой пробкой.

Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя ват- но-марлевую пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Запрещается ополаскивать посуду.

Место и время отбора пробы водопроводной воды определяют в зависимости от цели анализа: в наиболее характерных точках сети, а также в тех точках, в которых качество воды вызывает сомнение.

Пробы из водопроводных кранов и труб берут в период наибольшего расхода воды после предварительной стерилизации кранов обжиганием пламенем горящего ватного тампона, смоченного этиловым спиртом, и последующего спуска воды при полностью открытом кране не менее 5-10 мин. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без насадок (резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других).

Пробы воды отбирают в часы ее наибольшего расходования на предприятии. При обычном плановом санитарном контроле должно быть отобрано не менее 500 мл воды, для исследования на присутствие патогенных микроорганизмов – не менее 1 л.

Если воду отбирают после обеззараживания ее химическими веществами (например, хлорирования), то для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, перед ее стерилизацией в автоклаве вносят 2 мл 1,5 %-ного раствора тиосульфата натрия.

5

После наполнения емкость закрывают стерильной резиновой или каучуковой пробкой и колпачком. При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании пробы до лаборатории.

Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды, в котором указывают следующие данные:

место расположения крана или другой точки отбора проб;

дата отбора пробы с указанием года, месяца, числа и часа;

особые обстоятельства при отборе пробы (время спуска воды из крана, условия транспортировки и т.д.);

цель исследования: сделан ли отбор пробы по особым показаниям или в порядке текущего санитарного надзора;

фамилия специалиста, отбиравшего пробу.

Анализ пробы в лаборатории необходимо провести как можно быстрее от момента ее отбора: срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.

Доставку пробы воды осуществляют в продезинфицированных контейнерах-холодильниках при температуре 4-10 °С. Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч. после забора. Анализ пробы не проводится, если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения [1, 2].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Освоить методы микробиологического анализа воды. Провести микробиологический анализ воды из водопроводной сети централизованного водоснабжения.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; лупа с 2-5-кратным увеличением; фильтровальный аппарат; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор; стеклянный мостик; спир-

6

товка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; маркер.

Стерильные: бутылки для отбора проб вместимостью 500 мл с 2 мл 1,5 %-ного раствора тиосульфата натрия, закрытые ватными пробками, снабженные бумажными колпачками (хорошо подобранные притертые, каучуковые или корковые пробки, завернутые в бумагу, должны быть привязаны к горлышку флакона); пипетки вместимостью 1 мл, чашки Петри.

Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; раствор карболового генцианвиолета в капельнице; раствор Люголя в капельнице; раствор водного фуксина в капельнице; 70 %-ный этанол в стеклянной банке с крышкой; физиологический раствор в капельнице для приготовления препарата; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 °С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри; среда Гисса с глюкозой в пробирке; реактивы для определения оксидазной активности бактерий; фильтровальная бумага; мембранные фильтры.

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла; кусочек сухого мыла; хлопчатобумажная ткань для протирания стекол; полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Отбор пробы воды

1.Взять пинцетом ватный тампон, смочить его 96 %-ным этанолом, поджечь и простерилизовать кран обжиганием пламенем.

2.Спустить воду в течение 10-15 мин. при полностью открытом

кране.

3.Непосредственно перед отбором пробы снять с флакона бумажный пакет или колпачок вместе с пробкой, не касаясь пробки руками.

4.Наполнить флакон с таким расчетом, чтобы при транспортиро-

вании не замочить пробку. Объем отбираемой пробы – 500 мл.

7

5. Закрыть наполненный флакон каучуковой или корковой пробкой и стерильным бумажным колпачком, обвязать колпачок ниткой или бечевкой.

Определение общего количества бактерий в воде Первый этап

1.Питательный агар расплавить на водяной бане и охладить до температуры (45±5) °С.

2.Две стерильные чашки Петри разложить на столе и подписать фамилию студента, группу и дату посева.

3.С флаконов с пробой воды снять бумажные колпачки, вынуть пробки, горлышки профламбировать, после чего воду тщательно перемешать осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку.

4.Стерильной пипеткой отобрать 1 мл воды и внести в одну стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку. Стерильной пипеткой отобрать 1 мл воды и внести в другую стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.

5.После внесения воды в чашки Петри залить ее 10-12 мл расплавленного и охлажденного до 50±0,5 °С питательного агара при фламбировании краев колбы, где он содержится.

6.Воду быстро смешать с агаром, осторожно вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки. После этого чашки оставить на горизонтальной поверхности до застывания среды.

7.После застывания агара чашки с посевами поместить в термостат вверх дном не более чем по 3-4 чашки вместе. Посевы выращивать в термостате при 37±0,5 °С в течение 24±2 ч.

Второй этап

1. Колонии, выросшие на поверхности и в глубине агара, подсчитать при помощи лупы с увеличением в 2-5 раз.

8

Если в чашке выросло свыше 300 колоний, то допускается подсчитывать колонии при помощи лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см2 каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое число колоний на 1 см2, величину которого умножают на площадь чашки в см2, вычисленную по формуле S = r2.

2.Результат подсчета колоний выразить в количестве бактерий на 1 мл анализируемой воды (КОЕ/мл). Результаты округлить в соответствии с табл. 1.

3.Окончательный результат занести в отчет.

Таблица 1

Запись результатов определения микробного числа воды

Определение титра кишечной палочки методом мембранных фильтров

Первый этап

1.Мембранные фильтры, визуально проверенные на отсутствие трещин, отверстий, пузырей, и т.п., замочить в 70 %-ном этаноле в стеклянной банке с крышкой не менее чем на 30 мин., а затем использовать.

2.Взять пинцетом ватный тампон, смочить его 96 %-ным этанолом, поджечь и простерилизовать фильтровальный аппарат обжиганием пламенем. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) фламбированным пинцетом положить стерильный мембранный фильтр, прижать его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепить устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

3.В воронку (стакан) фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности налить 100 мл пробы воды и профильтровать.

9

4.После окончания фильтрования снять воронку, фильтр осторожно приподнять за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра, а затем перенести его, не переворачивая, на среду Эндо, разлитую

вчашку Петри, и плотно прижать к среде, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

5.В воронку (стакан) фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности налить 200 мл пробы воды и профильтровать.

6.После окончания фильтрования снять воронку, фильтр осторожно приподнять за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра, а затем перенести его, не переворачивая, на среду Эндо, разлитую

вчашку Петри, и плотно прижать к среде, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

На одну чашку можно поместить 3-4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

7.Под каждым фильтром на дне чашки сделать надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и фамилий студентов.

8.Чашки с фильтрами на среде Эндо поместить в термостат дном вверх и инкубировать при 37±0,5 °С в течение 18-24 ч.

Второй этап

1.При отсутствии роста колоний на фильтрах или при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний получить отрицательный результат.

2.При наличии на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, розовых, прозрачных), из нескольких колоний каждого типа приготовить мазки, окрасить их по Граму и промикроскопировать. При отсутствии

10