Пищевая микробиология. Лабораторный практикум

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы

Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, реактивы. Подробно описать методику проведения работы.

Разлить стерильную питательную среду (питательный агар) в две стерильные чашки Петри. Провести посев микроорганизмов воздуха на поверхность питательной среды седиментационым методом. Записать в отчете условия посева микрофлоры воздуха (состав среды, место и время посева, время экспозиции) и условия выращивания (температуру и продолжительность культивирования). Провести выращивание колоний микроорганизмов в термостате при заданной температуре. Подсчитать количество выросших колоний и рассчитать общее количество микроорганизмов в 1000 л исследуемого воздуха.

Результаты работы

Окончательный результат расчета общего количество микроорганизмов в 1000 л исследуемого воздуха занести в отчет.

Руководствуясь нормативами по оценке бактериальной загрязненности воздуха, приведенными в краткой теории к занятию, сделать вывод о санитарном состоянии воздуха исследуемого объекта и записать его в тетрадь.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Какие микроорганизмы могут быть обнаружены в атмосферном воздухе

ивоздухе закрытых помещений?

2.Для чего изучают микрофлору воздуха? Какие группы микроорганизмов выявляют и в каких случаях?

21

3.Существует ли разница в методических подходах к изучению воздушной среды закрытых помещений и атмосферы? Ответ поясните.

4.Какие показатели определяют при санитарно-гигиенической оценке воздуха? Какие микробиологические методы исследования воздуха вы знаете?

5.Каков принцип действия аппарата Кротова, его достоинства и недостатки?

6.В чем сущность седиментационного метода изучения воздуха? Какие исследования можно провести при помощи данного метода? Каковы недостатки седиментационного метода посева воздушной микрофлоры?

7.Как провести посев воздушной микрофлоры седиментационным методом?

8.Как провести количественный учет микроорганизмов в воздухе?

9.Каковы нормативы оценки санитарного состояния воздуха по показателю бактериальной загрязненности?

Лабораторная работа № 3 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИВОВАРЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА

Отбор проб

Пробы для микробиологического анализа отбирают с соблюдением условий, исключающих вторичное обсеменение посторонними микроорганизмами.

Жидкости и сыпучие вещества отбирают стерильными инструментами в стерильную стеклянную посуду. Пробу сыпучих материалов отбирают металлической или фарфоровой ложкой, шпателем или пробоотборником из разных мест и с разной глубины в одну или раздельную посуду в зависимости от цели исследования. Пробку и горлышко посуды фламбируют.

Пробу пастообразных и жидких продуктов из большой емкости отбирают с разной глубины. Пробу переносят в посуду, горлышко которой фламбируют.

При отборе пробы жидкости из емкостей, оснащенных краном, кран промывают, вытирают ватным тампоном, пропитанным этиловым спиртом, и обжигают в пламени факела или спиртовки; сливают часть жидкости (от 1 до 10 л в зависимости от вместимости резервуа-

22

ра и диаметра крана); пробу отбирают в стерильную посуду, горлышко которой предварительно фламбируют.

Масса или объём пробы должны быть достаточны для выполнения свего комплекса микробиологических исследований. На анализ отбирают: не менее 1 шт. – от продуктов в потребительской упаковке; до 500 мл (г) – жидких, пастообразных, сыпучих продуктов.

Отобранная проба предназначена для приготовления разведений или непосредственного посева в питательные среды.

Отобранные пробы переносят в лабораторию и приступают к их микробиологическому анализу. Если нет возможности сразу приступить к исследованиям отобранных образцов, их помещают в холодильник при температуре от 0 до 5 °С не более чем на 6 ч.

Пивные дрожжи

Отбор проб семенных дрожжей производят из каждой емкости. Пробы отбирают с разных уровней чистой пипеткой с расширенным концом или стеклянной трубкой и помещают в пробирки или небольшие колбочки.

Всеменных дрожжах методом микроскопирования определяют упитанность по гликогену, процент нежизнеспособных дрожжевых клеток и содержание бактерий. При микроскопировании обращают внимание на морфологию дрожжевых клеток. Наличие заостренных или сильно удлиненных клеток свидетельствует о дегенерации культуры или о заражении дикими дрожжами.

Всеменных дрожжах количество бактерий не должно превышать 1 % от общего числа дрожжевых клеток; количество нежизнеспособных дрожжевых клеток должно быть в пределах 5 %; 70-75 % дрожжей должны содержать гликоген. Дрожжи, не отвечающие данным требованиям, необходимо подвергать антисептической обработке.

Готовое пиво

Непосредственно перед вскрытием бутылок с пивом их перемешивают 10-кратным переворачиванием с донышка на пробку или круговым движением. После вскрытия горлышко стеклянных буты-

23

лок обжигают и отбирают пиво в объеме, необходимом для проведения анализа.

Определяют общее число микроорганизмов на питательном агаре и наличие бактерий группы кишечных палочек. Общее число микроорганизмов в 1 мл пива не должно превышать 500 клеток. Бактерии группы кишечных палочек должны отсутствовать в 1 мл разливного пива [4].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Освоить методы микробиологического анализа пивоваренного производства.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; маркер; резиновая груша; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Стерильные инструменты: пипетки вместимостью 1 мл и 10 мл; чашки Петри; колба вместимостью 100 мл, закрытая ватной пробкой.

Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; 70 %-ный этанол в широкогорлой стеклянной банке с крышкой вместимостью 100 мл; физиологический раствор в капельнице для приготовления препарата; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 °С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри.

Семенные пивные дрожжи в пробирке, закрытой ватной пробкой; проба пива в пластиковой бутылке.

Растворы: карболового генцианвиолета; раствора Люголя; раствора водного фуксина; 96 %-ного этанола; метиленового синего 1:40 в капельницах.

24

Стерильный 10 %-ный раствор карбоната натрия в колбе вместимостью 100 мл.

Пробирки с 9 мл стерильной водопроводной воды или 0,1 %-ным раствором пептона; пробирка с 9 мл среды Кесслер с поплавками (или комочками ваты).

Универсальная индикаторная бумага; спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Определение нежизнеспособных дрожжевых клеток

1.На предметное стекло нанести каплю анализируемых дрожжей, каплю метиленового синего 1:40 и накрыть покровным стеклом.

2.Через 2 мин. провести подсчет всех дрожжевых клеток и клеток, окрашенных в синий цвет (нежизнеспособных).

3.Подсчитать количество нежизнеспособных дрожжей не менее чем в 5 полях зрения. Нежизнеспособные дрожжи окрашиваются в синий цвет вследствие того, что клеточная оболочка и мембрана мертвых клеток не препятствует проникновению краски.

4.Количество нежизнеспособных дрожжевых клеток выразить в процентах от общего числа клеток.

Вскрытие упаковки с пробой продукта

Пробку бутылки с пробой пива протереть тампоном, смоченным 70 %-ным этанолом, который удалить путем свободного испарения.

Отбор навески из пробы

10 мл пива пипеткой перенести в стерильную, закрытую ватной пробкой стеклянную колбу вместимостью 100 мл и подогреть при частом перемешивании круговыми движениями на водяной бане при

25

температуре от 30 до 37 °С до тех пор, пока из него не перестанут выделяться пузырьки газа.

После этого пиво тщательно перемешать осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку и отобрать 1 мл стерильной пипеткой путем введения ее в глубину продукта.

Часть пива, оставшуюся на поверхности пипетки, оставить стечь к острию пипетки. Образующуюся каплю удалить прикосновением к внутренней стенке посуды над поверхностью продукта.

Приготовление десятикратного разведения пива

Стерильной пипеткой внести 1 мл пива в 9 мл стерильной водопроводной воды или 0,1 %-ного раствора пептона, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой пипеткой путем десятикратного насасывания и выдувания из него содержимого пробирки с помощью резиновой груши.

Интервал между приготовлением разведения пива и посева в питательные среды не должен превышать 30 мин.

Определение общего количества микроорганизмов в пиве Первый этап

1.Одновременно в две стерильные чашки Петри пипеткой высеять по 1 мл десятикратного разведения пива (в каждую чашку). При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывать и посевной материал вносить на дно чашки.

2.Затем в каждую чашку налить (18±2) мл расплавленного и охлажденного до (45±1) °С питательного агара и немедленно перемешать с посевным материалом осторожными круговыми движениями.

3.После застывания агаризованной среды чашки Петри перевернуть дном вверх и поместить в термостат.

4.Посевы инкубировать при температуре (30±1) °С в течение

(72±3) ч.

5.Через трое суток чашки Петри с посевами убрать в холодильник до следующего занятия.

26

Второй этап

1.Подсчитать количество колоний, выросших на чашках Петри. Для подсчета отобрать чашки Петри, на которых выросло от 15 до 300 колоний.

2.По результатам подсчета вычислить среднее арифметическое значение числа колоний, выросших на двух чашках Петри.

3.Полученные среднеарифметические значения округлить:

до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;

до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.

4. Количество микроорганизмов в 1,0 мл (г) продукта вычислить по формуле

M Vn C ,

где n – степень разведения навески;

V – объем инокулята, внесенный в чашку Петри, мл;

С – округленное среднеарифметическое значение числа колоний. Результат вычисления выразить числом от 1,0 до 9,9 × 10n.

Результаты определения общего числа микроорганизмов за-

писать следующим образом: «Общее число микроорганизмов … КОЕ/мл».

Если рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствует, то результат выразить следующим образом: «Общее число микроорганизмов < 1 КОЕ/мл».

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, меньше 15, результаты записать следующим образом: «Общее число микроорганизмов < (15 · n/V) КОЕ/мл».

27

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения превышает 300, то результат выразить следующим образом: «Общее число микроорганиз-

мов > (300 · n/V) КОЕ/мл».

Выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пиве

Первый этап

1.Пиво, находящееся в стеклянной колбе вместимостью 100 мл, после удаления из него углекислого газа нейтрализовать стерильным 10 %-ным раствором карбоната натрия, подбавляя его из стерильной пипетки, до рН 7. Реакцию среды проверить с помощью универсальной индикаторной бумаги.

2.1 мл пива стерильной пипеткой внести в пробирку с 9 мл среды Кесслер.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) °С

втечение 24-48 ч.

Второй этап

1.Посевы просмотреть через (24+3) ч., отметить положительные посевы в жидкие среды, а окончательный учет проводить через

(48±3) ч.

Положительными считать посевы в жидкие среды, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды и образовании газа.

2.При необходимости для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на жидких средах, к БГКП сделать пересевы на поверхность среды Эндо.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) °С

втечение (24±3) ч.

Третий этап

1. Просмотреть посевы и отметить рост характерных колоний: бледно-розового или красного цвета, часто с металлическим блеском.

28

2. При необходимости подтверждения принадлежности выросших микроорганизмов к БГКП из чашек Петри с посевами отобрать не менее чем по 5 колоний. Из каждой отобранной колонии приготовить мазок и окрасить по Граму.

БГКП являются грамотрицательными палочками.

Результаты определения количества колиформных бактерий

записать следующим образом: «БГКП обнаружены в 1 мл» или «БГКП в 1 мл не обнаружены».

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Количество нежизнеспособных дрожжевых клеток. Общее количество микроорганизмов в пиве. Количество бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пиве.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы

Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, реактивы. Подробно описать методику проведения работы.

Определить количество нежизнеспособных дрожжевых клеток. Сделать десятикратное разведение пива. Определить общее количество микроорганизмов в пиве. Выявить наличие бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пиве. Сравнить полученные показатели с нормативами, приведенными в краткой теории к занятию. Сделать выводы о качестве дрожжей и пива и записать их в отчет.

Результаты работы

Окончательные результаты анализов занести в тетрадь.

29

Сравнить полученные показатели с нормативами, приведенными в краткой теории к занятию.

Сделать выводы о качестве дрожжей и пива и записать их в тетрадь.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Как определить количество нежизнеспособных дрожжевых клеток?

2.Каковы общие принципы отбора проб продуктов для микробиологических анализов?

3.Как провести отбор проб от сыпучих веществ?

4.Как провести отбор проб от жидких и пастообразных продуктов?

5.Как провести отбор проб жидкостей из емкостей, оснащенных краном?

6.Когда необходимо провести анализ отобранной пробы?

7.Как и сколько времени можно хранить отобранные пробы?

8.Как вскрыть упаковку с пробой продукта?

9.Как отобрать навески и приготовить десятикратное разведение исследуемого продукта?

10.Как провести посев продукта в плотные среды глубинным методом?

11.Как провести посев навески продукта в жидкие среды?

12.Как провести выявление и подсчет микроорганизмов на плотных и в жидких средах? Как провести подтверждение характерных колоний?

13.Какие способы выражения результатов определения количества микроорганизмов подсчетом на чашках Петри и выявления наличия (отсутствия) микроорганизмов Вы знаете? Дайте их краткую характеристику, приведите примеры.

14.Как определить общее число микроорганизмов в пиве?

15.Как выявить наличие бактерий группы кишечных палочек в пиве?

30